Identifizierung, Isolierung und strukturelle Charakterisierung neuartiger forcierter Abbauprodukte von Ertugliflozin mithilfe fortschrittlicher Analysetechniken

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9472 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Forschung klärt das Stressabbauverhalten von Ertugliflozin auf, das zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern eingesetzt wird. Der Abbau wurde gemäß den ICH-Richtlinien durchgeführt und Ertugliflozin ist unter thermischen, photolytischen, neutralen und alkalischen Hydrolysebedingungen relativ stabil; Bei der Säurehydrolyse und der oxidativen Hydrolyse wurde jedoch ein erheblicher Abbau festgestellt. Abbauprodukte wurden mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie identifiziert, mittels semipräparativer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie isoliert und mittels hochauflösender Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie strukturell charakterisiert. Beim sauren Abbau wurden insgesamt vier Abbauprodukte identifiziert und isoliert, nämlich die Abbauprodukte 1, 2, 3 und 4. Unter oxidativen Bedingungen wurde das Abbauprodukt 5 identifiziert. Alle fünf gebildeten Abbauprodukte sind neu, was früher nicht berichtet wurde. Dies ist das erste Mal, dass eine vollständige strukturelle Charakterisierung aller fünf Abbauprodukte mithilfe einer kombinierten Analysetechnik dokumentiert wurde. In der vorliegenden Studie wurden hochauflösende Massen- und Kernspinresonanzspektroskopie eingesetzt, um eine konkrete Bestätigung der Strukturen der Abbauprodukte zu erhalten. Die aktuelle Methode wird auch genutzt, um zukünftig Abbauprodukte mit kürzerer Laufzeit zu identifizieren.

In Medikamenten gegen Typ-2-Diabetes wird Ertugliflozin als Inhibitor eingesetzt1,2,3. Es ist als Einzelmedikament und in Kombination mit Sitagliptin und Metformin HCl erhältlich. Die verfügbare Literatur auf dem Markt zeigt einige Validierungs- und Stabilitätsnachweise für die Entwicklung analytischer und bioanalytischer Techniken, die darauf hindeuten, dass Untersuchungen mit dem Arzneimittel (Ertugliflozin) und der Mischung aus Sitagliptin und Metformin möglich sind. Das Medikament Ertugliflozin (Markenname Steglatro) wird zur Behandlung von Typ-2-Diabetes eingesetzt. Die Food and Drug Administration hat es in den Vereinigten Staaten als Monotherapie und in einer festen Dosierungskombination mit Sitagliptin oder Metformin zugelassen4. Es wurde im März 2018 in Europa als Monotherapie oder Kombinationsbehandlung zugelassen. Ertugliflozin gehört zur Arzneimittelfamilie der Gliflozine und ist ein SGLT2-Hemmer. Segluromet wird in Verbindung mit Metformin verkauft und Steglujan wird in Kombination mit Sitagliptin angeboten.

Ertugliflozin wird unter dem Markennamen Steglatro vermarktet. Seine Summenformel lautet C22H25ClO7 (Molgewicht: 436,13) und die chemische Bezeichnung lautet 5-(4-Chlor-3-(4-ethoxybenzyl)phenyl)-1-(hydroxymethyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1 ]Octan-2,3,4-triol. Ertugliflozin liegt in Form eines Pyroglutaminsäuresalzes vor und erscheint als weißes, nicht hygroskopisches kristallines Pulver. Es ist in Aceton und Ethanol löslich, in Acetonitril und Ethylacetat leicht löslich und in Wasser nur schwer löslich. Abbildung 1 fasst die Struktur von Ertugliflozin und seinen Abbauprodukten zusammen. Bei der Durchsicht der Literatur wurden nur wenige Veröffentlichungen zur Analyse von Ertugliflozin einzeln und in Kombination mit Metformin und Sitagliptin entdeckt. Über die Entwicklung einer Ertugliflozin-Strategie wurde für die Kombination mit Metformin RP-HPLC5,6,7,8,9,10,11, mit Sitagliptin12,13,14,15,16,17,18 sowie in Kombination mit Metformin und Sitagliptin19 berichtet. Es wurde über mehrere bioanalytische Strategien unter Verwendung von LC-MS/MS-Ansätzen zum Nachweis von Sitagliptin im Plasma und Ertugliflozin20,21 berichtet. Bisher gab es jedoch keine Literatur zur Erklärung der Ertugliflozin-Abbauprodukte und ihrer Charakterisierung. Keine der Literatur lieferte NMR-, hochauflösende Massenspektrometrie- und IR-Untersuchungen der Abbauprodukte. Die vorliegende Studie erläutert die detaillierte strukturelle Charakterisierung aller 5 Abbauprodukte von Ertugliflozin. Daher war die aktuelle Forschung bestrebt, konkrete Beweise für die Strukturen der Abbauprodukte zu liefern. Dazu gehörte die chromatographische Methodenentwicklung der UHPLC-MS-Methode für ERG und seine 5 Abbauprodukte, die in 4 Minuten Laufzeit gut aufgelöst wurde, zusammen mit HRMS/MS, IR, und NMR-Experimente (1D, 2D).

Strukturen von Ertugliflozin und seinen Abbauprodukten.

Eine Probe des aktiven Arzneimittels Ertugliflozin wurde von führenden Pharmaunternehmen in Hyderabad bezogen. Die für die Forschung verwendeten Reagenzien und Chemikalien waren Natriumhydroxid, Salzsäure, 30 %iges Wasserstoffperoxid (analytische Qualität), Ameisensäure (LCMS-Qualität) und Acetonitril (HPLC-Qualität), bezogen von Honeywell Research Chemicals, Indien. Das für die Analyse verwendete Wasser stammte von einem Milli-Q-Gerät von Millipore, Amsterdam, Niederlande. Dimethylsulfoxid-d6 (NMR-Qualität) von Cambridge Isotope Laboratories, Inc. D, 99,9 % + 0,03 % v/v.

Die für die vorliegende Arbeit eingesetzten Analysegeräte und unterstützten Software sind UHPLC-MS-Instrumente von Acquity UHPLC Frontend mit Waters Single Quadrupol-Detektor und Maslynx 4.2-Software. HRMS-Instrument von Thermo mit Dionex Ultimate 3000 LC Frontend q-exactive Orbitrap MS mit ESI-Ionenquelle und X-Calibur-Software. Reinigungsgerät von Waters, Binärmodul 2545, Detektor 2489 und Autosampler 2707 mit Chrom-Scope-2.1-Software. NMR-Gerät von Bruker Avance neo 400 MHz mit Topspin 4.09-Software. Analysenwaage von Sartorius-SQP-F und Infrarotspektroskopiegerät von Shimadzu ir-afinity-1S und Laborlösungssoftware.

Die Auflösung der Flüssigkeitschromatographie wurde mit einem Single Quadrupol-Massendetektor (SQD2) von Waters erreicht, der mit einem Acquity UHPLC- und Photodiodenarray-Detektor (PDA)-Frontend verbunden war. Duale Polarität – negativ und positiv mit ESI-Quelle (Elektrospray-Ionisation) mit einem einzelnen Quadrupol-Massenspektrometer von Waters wurde für die Massenanalyse verwendet. Die MS-Optimierung erfolgte unter Verwendung eines Scanmodus von 100 bis 1200 Dalton (Da). Die Desolvatisierungstemperatur wurde bei 350 °C gehalten. Für den Desolvatisierungsstrom wurden 700 L h-1 Gas und für Kegelgas 60 L h-1 eingestellt. Das Flüssigchromatographie-Massenspektrometer-Gerät wurde mit dem MassLynx 4.1-Anwendungsmanager betrieben. Die Proben wurden bei einer Temperatur von 10 °C gehalten und mit einer kürzeren chromatographischen Laufzeit von 4,0 Minuten und einem Injektionsvolumen von 0,5 µL laufen gelassen.

Auf der Suche nach einer geeigneten, zuverlässigen und reproduzierbaren Methode wurden verschiedene Puffer mit unterschiedlichen Säulen getestet, um die Auflösung zu optimieren. Ursprünglich erfolgte die Methodenentwicklung unter Verwendung von Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Ammoniumbicarbonatpuffern und verschiedenen Säulen wie Acuity Phenyl, C18 und CSH C18. In zahlreichen Versuchen zeigte 0,1 % Ameisensäurepuffer mit Acquity BEH C18 positive und ermutigende Ergebnisse und die übrigen Versuche zeigten entweder eine schlechte oder eine schlechte Auflösung. Darüber hinaus wurden umfangreiche Versuche mit der Acquity-BEH-Säule mit verschiedenen Flussraten- und Gradientenbedingungen durchgeführt. Die optimale Trennung aller Abbauprodukte und API wurde auf der Waters Acquity UPLC BEH C18-Säule (50 × 2,1 mm, 1,7 µm) erreicht. Die mobile Phase umfasste die mobile Phase A und B mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die Trennung wurde mithilfe des Gradientenprogramms Zeit (min)/B-Konz. (%) erreicht: 0/3, 0,5/3, 2,5/98, 3,5/98, 3,6/03, 4/03 bei einer Flussrate von 0,4 ml/min und Säulentemperatur von 35 °C. Zur Überwachung der Eluenten wurde ein Photodiodenarray-Detektor (PDA) verwendet. Das Verdünnungsmittel wird im Verhältnis 1:1 (v/v) einer Mischung aus Wasser und Acetonitril verwendet. Alle 6 Peaks wurden in diesem Zustand mit guter Peakform und Auflösung getrennt. Die endgültige Spur der Methodenentwicklung ist in Abb. 2 dargestellt, und die Abbauspuren sind in Abb. 3 dargestellt.

Methodenentwicklung von Ertugliflozin und seinen Abbauprodukten in der Acquity BEH C18-Säule.

Ertugliflozin-Abbauweg: Säurehydrolyse (A) und oxidative Hydrolyse (B).

Die Proben wurden mit einer ESI-Quelle analysiert, die mit Thermo Q Exactive Orbitrap MS ausgestattet war; UHPLC Dionex Ultimate 3000 mit PDA-Detektor als Frontend. Die verwendeten Parameter der Instrumentenquelle waren: Sprühspannung: 3,5 kV; Hilfsgasdurchfluss: 14; Kapillartemperatur: 270 °C; Spülgasdurchfluss: 3; Zusatzgasheizung. Temperatur: 440 °C. Hüllgasdurchflussrate: 53. Massendaten wurden mit der Software xcalibur erfasst. Reserpin (monoisotopische Masse: 608,2734 Da) wurde als Standard zur Überprüfung der Genauigkeit des Massenanalysators verwendet. Die chromatographischen Bedingungen ähnelten UHPLC-MS. Die HRMS-Daten für alle Abbauprodukte sind in Abb. 4 dargestellt. Die in der HRMS-MS-Analyse erhaltenen Massenfragmentierungsdaten für alle Abbauprodukte sind in Tabelle 1 dargestellt.

HRMS- und HRMS-MS-Daten für Ertugliflozin und seine Abbauprodukte.

Semipräparativer HPLC 2489 Dual-UV-Detektor, 2545 Pumpenmodul und 2707 Probenmanager mit automatischem Fraktionssammler III von Waters. Das gesamte Instrument wurde mit der ChromScope-2.1-Software gesteuert und zur Isolierung der Abbauprodukte wurde das hausintern verpackte Luna C18 150 × 25 mm, 5 µm verwendet. Alle isolierten reinen Fraktionen wurden mit dem Lyofreeze-Lyophilisator lyophilisiert.

In sauren und peroxidischen Umgebungen wurde eine Verschlechterung beobachtet. Um die säurehydrolysierte Probe zu neutralisieren, wurde eine gesättigte Lösung von (NH4)2CO3 verwendet und die resultierende Lösung wurde durch Lyophilisierung verfestigt. Nach dem Verdünnen der Peroxidlösung wurde eingedampft, um einen freien Feststoff zu erhalten. Zur präparativen HPLC-Reinigung wurde die identische Probe in einer kleinen Menge der mobilen Phase gelöst.

1H-, 13C- und 2D-NMR-Spektren von Ertugliflozin und Abbauprodukten wurden in DMSO-d6-Lösungsmittel auf einem Bruker Avance Neo 400-MHz-NMR-Gerät analysiert, das mit einer 5-mm-Breitband-Beobachtungssonde (BBO) mit Shim-System eines Z-Gradienten mit Empfindlichkeiten von 225 ausgestattet ist :1 und 480:1. Das TMS-Signal (Tetramethylsilan) bei null ppm wurde als Referenz für 1H und das Septettsignal von 39,5 ppm von DMSO-d6 für 13C verwendet.

Das Shimadzu IR-Afinity-1S-Modell mit Laborlösungssoftware wurde verwendet, um die in den Verbindungen vorhandenen funktionellen Gruppen wie Alkohol, Keton und Chlorketon zu erkennen. KBr wurde als Dispersionsmedium zur Herstellung der Probenpellets verwendet.

Gemäß den ICH-Stabilitätsrichtlinien22,23,24,25,26 wurden verschiedene Parameter für den erzwungenen Abbau eingesetzt, z. B. thermische, photolytische Oxidation, neutrale, saure und basische Hydrolysebedingungen. Die Studie zum erzwungenen Abbau von ERG wurde wie in den ICH-Richtlinien für Stabilitätsstudien beschrieben durchgeführt. Die ERG-Standardlösung (10 mg mL−1). Ein Milliliter der Lösung wurde in einen 10-ml-Messkolben überführt und mit 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung bis zur Marke verdünnt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Ein Milliliter der Lösung wurde entnommen und mit ACN-Wasser (1:1 v/v) auf 10 ml aufgefüllt. Um eine Endkonzentration von 100 µg mL−1 zu erhalten, wurden weitere Untersuchungen zum Abbauverhalten durchgeführt. Zum Photoabbau wurden 25 mg ERG-Probe 48 Stunden lang in einer UV-Kammer UV-Licht mit 254 nm ausgesetzt. Für den thermischen Abbau wurden 25 mg ERG-Probe 48 Stunden lang bei 100 °C gehalten und für weitere Untersuchungen zur Beobachtung des Abbauverhaltens verwendet.

Für die Neutral-, Säure- und Basenhydrolysestudie wurde eine Standard-Stammlösung von ERG (10 mg mL−1) in ACN und Wasser (1:1 v/v) hergestellt. 1 ml ERG-Standard-Stammlösung wurde in einen 10-ml-Messkolben überführt. Füllen Sie dann bis zur Markierung auf, indem Sie Wasser für den neutralen Abbau, 1 N NaOH für den alkalischen Abbau und 1 N HCl für den sauren Abbau verwenden. (Anfangs wurde das gleiche Verfahren mit 0,1 N NaOH und 0,1 N HCl durchgeführt. Es wurde jedoch kein nennenswerter Abbau beobachtet. daher wurde die Stärke von Säure und Base auf 1 N erhöht). Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 60 °C gerührt. Ein Milliliter der Lösung wurde entnommen, neutralisiert und in einen 10-ml-Messkolben überführt. Dann wurde das Volumen mit Wasser aufgefüllt, um eine Endkonzentration von 100 µg mL−1 zu erhalten. Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um das Abbauverhalten zu ermitteln.

Die ERG-Verbindung ist unter neutralen, basischen Hydrolyse-, photolytischen und thermischen Bedingungen äußerst stabil und zeigte keinen Abbau, was die Stabilität von ERG unter den oben genannten Bedingungen bestätigt. Es wurde festgestellt, dass das Arzneimittel gegenüber saurer Hydrolyse und Peroxidbedingungen labil ist. Als Ergebnis wurde ein Abbau von ca. 15–20 % sowohl bei Peroxid (30 % H2O2 unter Rühren bei Raumtemperatur, bis zu 48 Stunden) als auch bei Säure (1 N HCl unter Rückfluss bei 60 °C Rührtemperatur, bis zu 48 Stunden) beobachtet. und Bedingungen. Detaillierte Abbaubedingungen und -ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt, und Abbauchromatogramme der Säurehydrolyse- und Peroxidbedingungen sind in Abb. 3 dargestellt. Unter Säurehydrolysebedingungen wurden 4 DPs gebildet (DP-1, DP-2, DP-3 und DP). -4), wohingegen im oxidativen Zustand ein Abbauprodukt (DP-5) gebildet wurde. Die bestätigten Strukturen aller DPs sind in Abb. 1 dargestellt.

Die Bildung von Abbauverunreinigungen verlief wie folgt: Zur Bildung von DP1 führte zunächst eine säurevermittelte elektrophile Substitution von protoniertem Formaldehyd in der ortho-Position wie in Verbindung 1 gefolgt von Ritter-Chemie mit Acetonitril zu DP1. Gemäß der Literatur im Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–62927, zersetzt sich der Zuckeranteil im Zielmolekül unter heißen sauren Bedingungen allmählich zu Formaldehyd. Dies fördert bei der Reaktion mit dem Zielmolekül in einem sauren Medium (wie im Manuskript angegeben) die Bildung von 3. Dieses wiederum reagiert mit Acetonitril (das als Lösungsmittel für Löslichkeitszwecke verwendet wird) unter Bildung von DP-1 durch Ritter-Chemie.

Bildung von DP2, der vorgeschlagene Abbauweg für die Bildung von DP2 basiert auf der Literatur (Chemical Engineering Journal 307, 2017, 877–883)28 unter sauren Bronsted-Bedingungen.

Bildung von DP3/DP4: Gemäß der Literatur im Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–629, wird der Zuckeranteil im Zielmolekül allmählich zersetzt, um Formaldehyd/Acetaldehyd und Essigsäure in unterschiedlichen Anteilen zu bilden29,30. Die gebildete Essigsäure war an der Veresterung des DP2 unter den herrschenden heißen sauren Bedingungen beteiligt. In ähnlicher Weise wird die freie Hydroxymethylgruppe über den SN2-Mechanismus chloriert. Dementsprechend protoniert die Säure die Hydroxylgruppe und wird sukzessive durch das Chlorid verdrängt, um das entsprechende DP4 zu bilden.

Bildung von DP5: Der vorgeschlagene Mechanismus für die Bildung von DP5 beruht auf der oxidativen Spaltung der Arylethoxygruppe unter Bildung des entsprechenden Phenols, d. h. DP5.

Mittels Massenspektrometrie (UHPLC-MS) wurden einzelne Proben analysiert, um die Ergebnisse aller Stressstudien zu bestimmen. Alle im Laufe der Zeit gebildeten Abbauprodukte und die Studienbedingungen für jede Einschränkung werden im experimentellen Abschnitt beschrieben. Fünf wesentliche Abbauprodukte wurden identifiziert, isoliert und durch UHPLC-MS-, Prep-HPLC-, HRMS-, 2D-NMR- und FTIR-Techniken charakterisiert. Die meisten dieser Abbauprodukte entstehen durch die Umlagerung des sechsgliedrigen Kohlenhydratrings von API in einen fünfgliedrigen Furanring.

Unter Peroxid- und Säurestressbedingungen wurde ein beträchtlicher Anteil von > 5 % der durch den Abbau entstehenden Abbauprodukte beobachtet. Als mobile Phase zur Reinigung wurden eine Luna C18-Säule (150 mm × 25 mm, 5 μm) und Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure in wässriger Lösung verwendet. Es wurden aufeinanderfolgende Injektionen roher Probenlösungen injiziert, und die Sammlung der Fraktionen erfolgte auf der Grundlage der UV-Reaktion und der späteren Massenbestätigung durch LC-MS. Fraktionen verschiedener Abbauprodukte werden getrennt gesammelt und lyophilisiert, um einen freien Feststoff zu erhalten.

Um die Strukturinformationen des Ertugliflozin API zu erhalten, wurden alle analytischen Daten zu Referenzzwecken aufgezeichnet. Unter ESI-MS-Positivmodusbedingungen wurden [M + H]+- und Ammoniak-Addukt-Ionen [M + H + NH3]+ als 437,1350 bzw. 454,1617 nachgewiesen, was bestätigt, dass die Summenformel für Ertugliflozin C22H25ClO7 ist. Die bestätigten Daten von Ertugliflozin sind unter HRMS, HRMS/MS-Spektrum (Abb. 4, Tabelle 1) und IR (Tabelle 4) aufgeführt. Der von HRMS/MS vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen von ERG ist in den ergänzenden Daten in Abb. S1 dargestellt. Der vorgeschlagene Strukturmechanismus zur Erklärung des Abbauverhaltens von Ertugliflozin unter sauren Hydrolyse- und Peroxidbedingungen ist in Abb. 5 dargestellt, und die strukturelle Konformation von ERG mittels 2D-NMR ist in Abb. 5 dargestellt. 6 und S2. Die strukturelle Konformation von ERG erfolgt durch HRMS und 2D-NMR. Alle anderen Abbauprodukte werden auf der Grundlage des Vergleichs dieser Strukturaufklärungsdaten charakterisiert.

Vorgeschlagenes Abbauverhalten von Ertugliflozin unter sauren Hydrolyse- und Peroxidbedingungen.

Illustrative NMR-Spektren für ERG, DP-1 und DP-2.

Die Behandlung mit Ertugliflozin mit Säure führte zum Abbauprodukt 1 (DP-1). Dieses Abbauprodukt wurde isoliert und seine Masse wurde im HRMS für die in Abb. 4 gezeigte Summenformel C25H30ClN5O8 mit [M + H]+ 508,1724 (− 1,7675 ppm Fehler) bestätigt. Das HRMS-Spektrum bestätigt das Vorhandensein eines Chloratoms im Struktur. Die vollständige Struktur des Abbauprodukts wurde durch NMR- und HRMS-Untersuchungen bestimmt. Die Probe wurde in DMSO-d6-Lösungsmittel hergestellt und einer NMR-Analyse unterzogen. Zunächst wurden 1H-NMR- und D2O-Austauschexperimente aufgezeichnet. Ein Vergleich der 1H- und D2O-Daten bestätigt das Vorhandensein von fünf austauschbaren Protonen in der Verbindung und im aromatischen Bereich, wobei das 1,4-disubstituierte Ringmuster fehlt und das Muster eines 1,2,4-trisubstituierten Rings vorhanden ist. Der Hauptunterschied zur API-Verbindung ist das Vorhandensein von sekundärem Amid (H32), Methylenprotonen (H31) und einer Acetylgruppe (H34). Im 1H-NMR waren insgesamt 30 Protonen vorhanden, das sekundäre Amid liegt bei 8,08 ppm und aromatische Protonen wurden zwischen 6,0 und 8,0 ppm nachgewiesen. Primäre und sekundäre alkoholische Protonen liegen bei 4,5–5,5 ppm und die Resonanz aliphatischer Protonen liegt zwischen 1,0 und 4,5 ppm. N-Methylen-Protonen liegen bei 4,15 ppm und Acetyl-Protonen bei 1,85 ppm. O-Methylen liegt bei 4,00 ppm und aromatische Methylenprotonen bei 3,97 ppm. Im 13C-NMR wurden insgesamt 25 Kohlenstoffe nachgewiesen; Der größte Teil des Kohlenstoffs im unteren Feld ist Acetamidcarbonyl mit 169,26 ppm, gefolgt vom quartären Kohlenstoff mit O-Ethyl-Gruppe bei 154,36 ppm. Die verbleibenden aromatischen Kohlenstoffe lagen zwischen 100 und 140 ppm, aliphatische Kohlenstoffe lagen bei 10–90 ppm. Im HSQC-Experiment wurde bestätigt, dass an H31-Methylenprotonen gebundene Kohlenstoffe bei 37,16 ppm und an N-Acetyl-Protonen gebundene Kohlenstoffe bei 22,47 ppm angezeigt werden. Im gDQ-COSY-Experiment zeigten H31-Protonen eine Korrelation mit dem H32-Proton. Im 1H-15N HSQC-Experiment wurde bestätigt, dass das H32-Proton ein amidisches NH-Proton ist und sein Stickstoffwert bei 115 ppm liegt. Im 1H-13C-HMBC-Experiment zeigten H31-, H32- und H34-Protonen eine Konnektivität mit C33-Kohlenstoff und H31-Protonen zeigten Konnektivität mit C9-, C10- und C11-Kohlenstoff. Alle wichtigen Informationen der 1D- und 2D-NMR-Daten bestätigen, dass der 1,4-disubstituierte Ring in Benzylacetamid umgewandelt wurde. Schließlich bildete sich N-(5-(2-Chlor-5-(2,3,4-trihydroxy-1-(hydroxymethyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-5-yl)benzyl)- 2-Ethoxybenzyl)acetamid und das 2D-NMR-Spektrum sind in den Abbildungen dargestellt. 6 und S3. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und der vorgeschlagene Abbaumechanismus ist in Abb. 5 dargestellt.

Darüber hinaus gibt die Streckungsfrequenz bei 3415 cm-1 in FT-IR-Spektren das Vorhandensein von NH- und OH-Gruppen an, und die Streckungsfrequenz von 1645 cm-1 weist auf das Vorhandensein von Amidketogruppen hin. Die Streckungsfrequenz bei 811 cm−1 lässt auf die Existenz der C-Cl-Gruppe schließen. Ein signifikantes FT-IR-Spektrum bestätigte die Existenz von Keto-, Amid-, Alkohol- und Chlorid-Funktionsgruppen, wie in Tabelle 4 dargestellt. Für DP-1 wurden das HRMS/MS-Spektrum und der vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen in den Abbildungen gezeigt. 4 und S1.

Die DP-2-Verbindung wurde durch saure Hydrolyse der ERG-Verbindung gebildet. Um Strukturinformationen zu erhalten, wurde eine DP-2-HRMS-Analyse durchgeführt und 371,1037 [M + H]+ als protoniertes Molekül mit einem Fehler von − 2,0463 ppm für die berechnete Summenformel C21H19ClO4 (siehe Abb. 4) erhalten. Das HRMS-Spektrum bestätigt das Vorhandensein von ein Chloratom in der Struktur, und die Masse des Abbauprodukts hat 66 Einheiten weniger als die des Ausgangsprodukts Ertugliflozin. Um die genaue Struktur des Abbauprodukts zu erhalten, wurden 1D- und 2D-NMR-Experimente durchgeführt. Die 1H-NMR-Daten von DP-2 zeigten extreme Unterschiede zur API-Verbindung. Hier konnten wir die bicyclischen Ringprotonen nicht sehen und bemerkten das primäre Alkoholproton bei 5,56 ppm als Triplett, es wurde im D2O-Austausch ausgetauscht. Die Methylenprotonen erscheinen als Dublett bei 4,51 ppm, die Furanringprotonen bei 6,59 und 7,28 ppm mit einem J-Wert von 3,2 Hz. Im aromatischen 1,4-disubstituierten Ring waren 1,2,4-trisubstituierte Musterprotonen wie bei der Ausgangsverbindung mit 6–8 ppm vorhanden, und im aliphatischen Bereich wurden O-Ethoxy-Protonen und Methylenprotonen zwischen 1,0 und 4,5 ppm gezeigt. Im 13C-NMR wurden aufgrund der Symmetrie der Kohlenstoffe C9–C13 und C10–C12 insgesamt 19 Kohlenstoffe angezeigt, die jeweils ein Signal zeigten. Der größte Teil des Downfield-Kohlenstoffs ist ein Keton und liegt bei 180,11 ppm. Quartäre Kohlenstoffe des Furanrings liegen bei 150,15 und 161,7 ppm, und der an O-Ethoxy gebundene Arylkohlenstoff liegt bei 157,05 ppm. Die restlichen Arylkohlenstoffe liegen bei 110–140 ppm. Im aliphatischen Bereich wurden 4 Kohlenstoffe nachgewiesen, der wichtigste Methylenkohlenstoff liegt bei 55,94 ppm, was durch HSQC-Experiment bestätigt wurde. Eine weitere wichtige Information aus dem HSQC-Experiment ist die Identifizierung der protonierten Kohlenstoffe des Furanrings. Im COSY-Experiment zeigte das primäre Alkoholproton H26 eine Korrelation mit den Methylenprotonen H25, und die Furanringprotonen H21 und H22 zeigten eine Korrelation miteinander. Das g-HMBC-Experiment bestätigt, dass H25-Protonen eine Verbindung zu C22- und C23-Kohlenstoffatomen aufweisen und H1- und H3-Protonen eine Verbindung zu C18-Kohlenstoffatomen aufweisen. Basierend auf NMR-Daten kam man zu dem Schluss, dass der bicyclische Ring neu angeordnet wurde und 2,5-substituierte Furanringe gebildet wurden, wie in den Abbildungen dargestellt. 6 und S4 und bildete (4-Chlor-3-(4-ethoxybenzyl)phenyl)(5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)methanon. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und der vorgeschlagene Abbaumechanismus ist in Abb. 5 dargestellt.

Darüber hinaus bestätigt die Streckungsfrequenz bei 3481 cm-1 in FTIR-Spektren das Vorhandensein von OH-Gruppen, und die Streckungsfrequenz bei 1637 cm-1 gibt das Vorhandensein von Ketogruppen an. Die Streckfrequenz bei 756 cm−1 weist auf das Vorhandensein der C-Cl-Gruppe hin. Signifikante FT-IR-Frequenzen bewiesen das Vorhandensein von funktionellen Alkohol-, Keto- und Chlorgruppen, wie in Tabelle 4 dargestellt. Für DP-2 wurden das HRMS/MS-Spektrum und der vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen in den Abbildungen gezeigt. 4 und S1.

Die saure Hydrolyse der ERG-Verbindung führte zur DP-3-Verbindung. Um Strukturinformationen von DP-3 zu erhalten, wurde eine HRMS-Analyse durchgeführt und das protonierte Molekül [M + H]+ als 413,1139 mit einem Fehler von −2,8246 ppm beobachtet, was die berechnete Summenformel C23H21ClO5 in Abb. 4 bestätigt. Die Masse des Abbauprodukts hat um 24 Einheiten weniger als das von ERG, und die genaue Struktur zu kennen. Zusätzlich wurden NMR-Experimente aufgezeichnet. Das 1D-NMR der DP-3-Verbindung ist fast wie DP-2, es wurden kaum Unterschiede beobachtet, anstelle des alkoholischen Protons war eine Acetylgruppe zu sehen. Im 1H-NMR sind insgesamt 21 Protonen vorhanden, wobei die 9 Protonen aus der aromatischen Region und die Furanringprotonen bei 6,79 und 7,32 ppm mit J = 3,6 Hz angezeigt werden. Im aliphatischen Bereich waren insgesamt 12 Protonen vorhanden, wobei 3 Methylengruppen zwischen 3,5 und 5,5 ppm und Acetylgruppenprotonen mit 2,07 ppm nachweisbar waren. Im 13C-NMR beträgt die Kohlenstoffzahl 21, wobei 16 Kohlenstoffe aus dem aromatischen und 5 Kohlenstoffe aus dem aliphatischen Bereich stammen. Der am weitesten unten liegende Kohlenstoff ist Keton mit 180,22 ppm, gefolgt von O-Acetyl mit 169,86 ppm und O-ethoxygebundenem Arylkohlenstoff mit 157,05 ppm. Die quartären Kohlenstoffe des Furanrings liegen bei 150,92 und 154,92 ppm, protonierte Kohlenstoffe liegen bei 122,12 und 112,85 ppm, verbleibende Kohlenstoffe wurden zwischen 110 und 140 ppm angezeigt, aliphatische Kohlenstoffe wurden bei 10–65 ppm angezeigt. Um protonierte Kohlenstoffe aus der Gesamtzahl der Kohlenstoffe zu identifizieren, wurde ein HSQC-Experiment durchgeführt, das bestätigt, dass die O-Methylen-Kohlenstoffe C25 57,47 ppm und C15 62,86 ppm betragen und die protonierten Kohlenstoffe des Furanrings bei 122,12 und 112,85 ppm lagen. Im COSY-Experiment H21 zeigen H22-Protonen Korrelationen. Um die 2J- und 3J-Korrelationen zu überprüfen, hat das DP-3-Verbindungs-HMBC-Experiment sehr geholfen. Hier waren die wichtigsten Korrelationen: H25- und H28-Protonen zeigen Konnektivität zu C27-Kohlenstoff, H25 zeigte Konnektivität zu C22- und C23-Kohlenstoffen und H1- und H3-Protonen zeigten Konnektivität zu C18 Kohlenstoff und diese verbleibenden Konnektivitäten passen zur Struktur. Die Struktur des Abbauprodukts 3 war (5-(4-Chlor-3-(4-ethoxybenzyl)benzoyl)furan-2-yl)methylacetat, und das 2D-NMR-Spektrum ist in den Abbildungen dargestellt. 7 und S5. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und der vorgeschlagene Abbaumechanismus ist in Abb. 5 dargestellt.

Illustrative NMR-Spektren für DP-3, DP-4 und DP-5.

Eine weitere Bestätigung mittels FT-IR und einer Streckfrequenz von 1744 und 1645 cm−1 weist auf das Vorhandensein von Ketogruppen hin, und Signale bei 1349 und 1039 cm−1 bestätigen das Vorhandensein von CO-Gruppen. Kein Signal im Bereich von 3400–3000 cm−1 bestätigt, dass in der Struktur keine OH- und NH-Protonen vorhanden sind. Die Streckfrequenz bei 756 cm−1 weist auf das Vorhandensein der C-Cl-Gruppe hin. Ein signifikantes FT-IR-Spektrum bestätigte das Vorhandensein von Keto- und Chlorfunktionsgruppen, wie in Tabelle 4 aufgeführt. Für DP-3 sind das HRMS/MS-Spektrum und der vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen in den Abbildungen dargestellt. 4 und S1.

DP-4 führte zur Behandlung von ERG mit Säure. Nach der Isolierung wurde HRMS aufgezeichnet, um seine Masse zu ermitteln. Für strukturelle Informationen von DP-4 wurde eine HRMS-Analyse durchgeführt und das protonierte Molekül [M + H]+ 389,0694 mit einem Fehler von – 2,9529 ppm für die in Abb. 4 gezeigte Summenformel C21H18Cl2O3 und das HRMS-Spektrum mit dem Dichlormuster erhalten, das dem entspricht Verbindung mit zwei Chloratomen. Es enthält 48 Einheiten weniger im Vergleich zur ERG-Ausgangsverbindung. NMR-Studien leiteten die genaue Struktur von DP-4 ab. Die Probe wurde in DMSO-d6-Lösungsmittel hergestellt und die erforderlichen 1D- und 2D-NMR-Analysen wurden durchgeführt, um die Struktur von DP-4 herauszufinden. Die 1H-NMR-Daten zeigen 18 Protonen, und es wurde ein geringfügiger Unterschied zwischen den 1H-NMR-Daten von DP-2 und DP-4 beobachtet, d. h. das alkoholische Proton fehlt, in DP-4 wird H25-Methylen als Singulett bei 4,93 ppm angezeigt. Die Protonen des Furanrings wurden bei 6,82 und 7,31 ppm mit J = 3,6 Hz gezeigt. Zwei starke Dubletts H9, H13 und H10, H12 werden bei 7,15, 6,86 ppm angezeigt, H1-, H2- und H3-Protonen liegen zwischen 7,5 und 7,9 ppm und aliphatische Protonen werden zwischen 1 und 5 ppm angezeigt. Im 13C-NMR beträgt die Kohlenstoffzahl 19, was auf die Symmetrie des 1,4-disubstituierten Rings zurückzuführen ist, statt der 6 beobachteten 4 Signale. Der größte Teil des Downfield-Kohlenstoffs ist Keton und liegt bei 180,21 ppm, der Rest der Kohlenstoffe liegt bei 110–160 ppm. Im aliphatischen Bereich wurden vier Kohlenstoffe angezeigt, der wichtigste Methylenkohlenstoff bei C25 liegt bei 36,88 ppm, O-Ethoxykohlenstoffe liegen bei 14,63 und 62,86 ppm, Methylenkohlenstoff C7 liegt bei 37,37 ppm. Durch das HSQC-Experiment wurden die protonierten Kohlenstoffe validiert. Die Verschiebungen des protonierten Kohlenstoffs im Furanring zeigten sich bei 122,26 und 112,62 ppm. In HMBC-Experimenten wurden zwei wichtige Konnektivitäten in diesem H25-Proton beobachtet, die eine 2J-Korrelation mit C23-Kohlenstoff und eine 3J-Korrelation mit C22-Kohlenstoff zeigten. Die zweite wichtige Konnektivität sind H1- und H3-Protonen mit C18-Kohlenstoffkonnektivität. Alle wichtigen Informationen der NMR-Daten bestätigen, dass der bicyclische Ring neu angeordnet wurde und ein 1,5-substituierter Furanring gebildet wurde. Als Ergebnis wurden die Struktur, die (4-Chlor-3-(4-ethoxybenzyl)phenyl)(5-(chlormethyl)furan-2-yl)methanon bildet, und das 2D-NMR-Spektrum in den Abbildungen dargestellt. 7 und S6. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und der vorgeschlagene Abbaumechanismus ist in Abb. 5 dargestellt.

Das FTIR-Spektrum zeigt das Vorhandensein des Signals 1649 cm-1 an, was auf das Vorhandensein der Ketogruppe hinweist, und Signale bei 1305 und 1246 cm-1 weisen auf das Vorhandensein von CO-Gruppen hin. Die Streckungsfrequenz bei 841.703 cm−1 weist auf das Vorhandensein der C-Cl-Gruppe hin. Kein einzelnes Element im Bereich von 3400–3000 cm−1 bestätigt, dass in der Struktur keine OH- und NH-Protonen vorhanden sind. Die FT-IR-Signale im Spektrum stimmen mit der Struktur von Chlor- und Keto-Funktionsgruppen überein, wie in Tabelle 4 gezeigt. Für DP-4 sind das HRMS/MS-Spektrum und der vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen in den Abbildungen dargestellt. 4 und S1.

Das Abbauprodukt 5 entstand durch die Behandlung der API-Verbindung mit Wasserstoffperoxid. Für die DP-5-Strukturinformationen wurde eine HRMS-Analyse durchgeführt und das protonierte Molekül [M + H]+ von 409,1037 mit einem Fehler von −2,9086 ppm für die in Abb. 4 dargestellte Summenformel C20H21ClO7 beobachtet. Aus den Massendaten geht hervor, dass es sich um 28 Einheiten handelt waren kleiner als die API-Ausgangsverbindung und hatten ein Chloratom in der Struktur. NMR-Studien haben die vollständige Charakterisierung von DP-5 durchgeführt. Wir haben obligatorische NMR-Experimente für eine in DMSO-d6 gelöste Probe aufgezeichnet. Primärexperimente von NMR 1H und D2O besagen, dass in 1H-NMR-Daten 21 Protonen gezeigt wurden, im D2O-Austauschexperiment wurden 5 Protonen ausgetauscht und es wurden 16 Protonen angezeigt. Somit wurde das Vorhandensein von fünf labilen Protonen in der Verbindung bestätigt. Der Hauptunterschied zwischen der DP-5-Verbindung und der Ausgangsverbindung ist das Fehlen einer O-Ethoxygruppe und das Vorhandensein eines phenolischen OH-Protons bei 9,24 ppm; Die restlichen 4 labilen Protonen liegen zwischen 4,5 und 5,5 ppm (1° und 2° alkoholisch). Im aromatischen Bereich liegen 1,4-disubstituierte Ringprotonen bei 6,66 und 6,97 ppm, Chlor-substituierte Ringprotonen bei 7,1–7,5 ppm und aliphatische Methin- und Methylenprotonen zwischen 3 und 4 ppm. Im 13C-NMR wurden 7 Kohlenstoffe im aliphatischen Bereich und 11 Signale im aromatischen Bereich angezeigt. Stärker entschirmender Kohlenstoff ist phenolischer OH-basierter quaternärer Kohlenstoff, verbleibende aromatische Signale wurden zwischen 100 und 140 ppm gezeigt. Im aliphatischen Bereich wurden O-gebundene Methylen- und Methinkohlenstoffe zwischen 55 und 90 ppm nachgewiesen, aromatische Methylenkohlenstoffe liegen bei 37,70 ppm. Im HSQC-Experiment wurden die Verschiebungen der Methylen- und Methinkohlenstoffe bestätigt. Im COSY-Experiment zeigte das H24-Proton eine Verbindung zu H19, H23 zeigt eine Verbindung zu H20, das H22-Proton weist eine Verbindung zu H21-Protonen auf und H28 zeigt eine Korrelation mit H25-Protonen. Diese Konnektivitäten helfen bei der Identifizierung der Methin- und Methylenprotonen. Im HMBC-Experiment werden nur wenige wichtige 3J-Korrelationen beobachtet. H1-, H3- und H27-Protonen zeigen Konnektivität mit C16-Kohlenstoff. Außerdem zeigen H7-Protonen eine 3J-Konnektivität zu C3, C5 und C9, C13; 2J-Konnektivität zu C4- und C8-Kohlenstoffen. NMR- und Massendaten bestätigten, dass sich die Ethoxygruppe von der Stammgruppe löste und am 1,4-disubstituierten Ring phenolisches OH bildete. Die Struktur des DP-5 wurde aufgeklärt und das NMR-Spektrum in den Abbildungen dargestellt. 7 und S7. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und der vorgeschlagene Abbaumechanismus ist in Abb. 5 dargestellt. Die FT-IR-Analyse bestätigt auch das Vorhandensein einer OH-Gruppe bei einer Streckfrequenz von 3443 cm−1. Die Streckfrequenz bei 755 cm−1 weist auf das Vorhandensein der C-Cl-Gruppe hin. Kein Signal im Bereich von 1750–1600 cm−1 bestätigt das Fehlen der Ketogruppe in der Struktur. Zentrale Frequenzen belegen das Vorhandensein von Alkohol und funktionellen Chloridgruppen. Die Daten sind in Tabelle 4 aufgeführt. Für DP-5 sind das HRMS/MS-Spektrum und der vorgeschlagene vorläufige Mechanismus für protonierte Fragmentierungsionen in den Abbildungen erfasst. 4 und S1.

Die Abbaustudie von Ertugliflozin unter Stressbedingungen wurde gemäß den ICH-Richtlinien untersucht. Das API wurde oxidativen, sauren, alkalischen, neutralen, photolytischen und thermolytischen Abbaubedingungen ausgesetzt. Das Arzneimittel war unter basischen, neutralen, thermischen und photolytischen Bedingungen stabil und es wurden keine Abbauprodukte beobachtet. Allerdings wurden unter Säure- und oxidativem Stress-Hydrolysebedingungen fünf Abbauprodukte gebildet. Diese Abbaustoffe entstehen durch Umlagerung des Ringes, der gegenüber saurer Hydrolyse labil ist (DP-1, DP-2, DP-3 und DP-4), und DP-5 wurde durch Entfernen der Ethylgruppe in Gegenwart von gebildet Peroxidbedingungen. Alle Abbauprodukte wurden mithilfe verschiedener Analysetechniken wie NMR (1D- und 2D-Experimente) und HRMS/MS-Experimente vollständig abgetrennt und charakterisiert. FT-IR-Daten lieferten einen zusätzlichen Zusatz zur Bestätigung der Strukturen. Alle fünf DPs sind neuartige Produkte und werden in keiner Literatur beschrieben. Die aktuelle Studie liefert die vollständige strukturelle Interpretation von Ertugliflozin und allen fünf Abbauprodukten mithilfe von HRMS-, FTIR- und 2D-NMR-Studien. Es wird auch über eine gut entwickelte UHPLC-MS-Methode zur Trennung aller Abbauprodukte mit guter Auflösung berichtet.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Ertugliflozin

Wirkstoff

Internationaler Rat für Harmonisierung

Natriumglukose-Cotransporter 2

Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Hochauflösende Massenspektrometrie

Zweidimensionale Kernspinresonanzspektroskopie

Einzelner Quadrupoldetektor

Photodiodenarray-Detektor

Elektrospray-Ionisation

Gradienten-Doppelquantenfilter-korrelierte Spektroskopie

Gradientenheteronukleare Einzelquantenkohärenzspektroskopie

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Fachbereich Chemie, GITAM School of Science, GITAM gilt als Universität, Visakhapatnam, 530045, Andhra Pradesh, Indien

Suresh Salakolusu & Ganapavarapu Veera Raghava Sharma

Fachbereich Chemie, GITAM School of Science, GITAM gilt als Universität, Hyderabad, 502329, Telangana, Indien

Naresh Kumar Katari

School of Chemistry and Physics, College of Agriculture, Engineering and Science, Westville Campus, University of KwaZulu-Natal, P Bag X 54001, Durban, 4000, Südafrika

Naresh Kumar Katari und Sreekantha Babu Jonnalagadda

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SS führte alle experimentellen Analysen in dieser Forschungsarbeit durch, einschließlich der Reinigung und HRMS-Analyse. NKK beteiligte sich an der Gestaltung der Arbeit, führte die statistische Analyse durch, verfasste das Manuskript und überwachte. GVRS trug zur theoretischen Analyse bei und half beim Vergleich theoretischer und experimenteller Testergebnisse. MK half bei der Literatursammlung und Ausführung der Arbeit. UP war an der Interpretation von Abbauprodukten beteiligt. MR wurde für die NMR-Analyse von Abbauprodukten unterstützt. SB Jonnalagadda wurde das Manuskript überprüft und bearbeitet. Wir stimmen der Veröffentlichung des Artikels ohne Widerspruch zu.

Korrespondenz mit Naresh Kumar Katari oder Ganapavarapu Veera Raghava Sharma.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Salakolusu, S., Katari, NK, Sharma, GVR et al. Identifizierung, Isolierung und strukturelle Charakterisierung neuartiger forcierter Abbauprodukte von Ertugliflozin mithilfe fortschrittlicher Analysetechniken. Sci Rep 13, 9472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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Eingegangen: 15. Januar 2023

Angenommen: 31. Mai 2023

Veröffentlicht: 10. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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