Die gegenseitige Modulation der Ammoniak- und Melaninproduktion hat Auswirkungen auf die Virulenz von Kryptokokken

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 849 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Pilz Cryptococcus neoformans ist der Erreger der Kryptokokkose, einer Krankheit, die ohne Behandlung mit Antimykotika durchweg tödlich verläuft. Aktuelle Therapien werden jedoch durch Wirtstoxizität und Krankheitserregerresistenz behindert. Ein attraktiver alternativer Ansatz zur Bekämpfung dieser tödlichen Krankheit ist die direkte Bekämpfung pathogener Virulenzmechanismen. C. neoformans exprimiert mehrere Virulenzfaktoren, die zuvor als isolierte Einheiten untersucht wurden. Dazu gehören Urease, die den phagosomalen pH-Wert erhöht und die Invasion des Gehirns fördert, sowie Melanisierung, die vor Immunzellen und antimykotischen Behandlungen schützt. Hier berichten wir über eine wechselseitige Abhängigkeit zwischen diesen beiden Virulenzfaktoren. Zellen, die Harnstoff hydrolysieren, setzen Ammoniakgas frei, das auf Distanz wirkt, um den pH-Wert zu erhöhen und die Melanisierungsraten für benachbarte Zellen zu erhöhen, was wiederum die Sekretion von Urease-tragenden extrazellulären Vesikeln verringert. Diese wechselseitige Beziehung manifestiert sich als eine aufkommende Eigenschaft, die erklären könnte, warum es schwierig war, isolierte Virulenzmechanismen für die Arzneimittelentwicklung gezielt ins Visier zu nehmen, und spricht für einen ganzheitlicheren Ansatz, der das Virulenzkomposit berücksichtigt.

Virulenzfaktoren sind Merkmale, die infektiösen Mikroben die Fähigkeit verleihen, infizierte Wirte trotz Immunantworten zu schädigen und in ihnen zu überleben1. Obwohl Krankheitserreger dazu neigen, mehrere Virulenzfaktoren zu nutzen, darunter Oberflächenbeschichtungen, Toxine und Enzyme, konzentrieren sich die meisten Studien auf den unabhängigen Beitrag eines einzelnen Faktors zur Pathogenität, ohne seinen Beitrag zur Virulenzzusammensetzung zu berücksichtigen2. Die Mechanismen, durch die Virulenzfaktoren interagieren, sind ein relativ unerforschtes Thema in der mikrobiellen Pathogenese.

C. neoformans exprimiert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, zu denen unter anderem eine Polysaccharidkapsel, die Melaninproduktion und die Expression verschiedener Enzyme wie Urease und Phospholipase gehören. Die Polysaccharidkapsel und das Melaninpigment schützen vor Phagozytose bzw. oxidativen Ausbrüchen phagozytischer Zellen3,4. Urease ist ein Ernährungsenzym, das nebenbei die phagosomale Ansäuerung stört, indem es Harnstoff zur Bildung von Ammoniak hydrolysiert5 und eine entscheidende Rolle bei der Gehirninvasion spielt6,7, während Phospholipase die phagosomalen Membranen von Makrophagen schädigt und das intrazelluläre Überleben fördert8. Es gibt nur wenige Informationen darüber, wie diese Virulenzfaktoren miteinander interagieren.

Diese Studie charakterisiert die Wechselwirkung zwischen Kryptokokken-Ureaseaktivität und Melanisierung. Urease wird in extrazellulären Vesikeln freigesetzt und hydrolysiert Harnstoff unter Bildung von Ammoniak, das hier gezeigt wird, dass es durch seine Fähigkeit, sich als Gas zu bewegen, eine Fernwirkung vermittelt. Die Melanisierungsreaktion ist pH-abhängig und wird dadurch durch eine erhöhte Ammoniakproduktion durch Urease gefördert. Es wurde festgestellt, dass eine verstärkte Melanisierung die Persistenz von Kryptokokkenzellen in Phagosomen begünstigt und dadurch die Verbreitung im Gehirn durch einen Trojaner-Mechanismus erhöht. Die Melaninablagerung in der Zellwand wirkt als Rückkopplungsmechanismus, indem sie die extrazelluläre Vesikelproduktion reduziert und so die Freisetzung von Vesikel-assoziierter Urease hemmt. Daher weisen Urease und Melanin eine wechselseitige Modulation auf, die in verschiedenen Infektionsstadien Vorteile bietet, und diese Koordination und Synergie der Virulenzfaktoren führt zu phänotypischen Veränderungen, die bei der isolierten Untersuchung jeder Komponente nicht vorhersehbar gewesen wären.

Bei der Untersuchung der Ureaseaktivität von C. neoformans in schneller Harnstoffbrühe9 stellten wir fest, dass mit längerer Inkubationszeit auch der pH-Wert der Medien in zellfreien Vertiefungen anstieg (Abb. 1a, linkes Feld). Die Messung der Absorption bei 560 nm (A560) für jede Vertiefung ergab einen direkten linearen Zusammenhang zwischen der Farbänderung in der zellfreien Vertiefung und der Anzahl der Zellen in der angrenzenden Vertiefung (Abb. 1a, rechtes Feld). Um festzustellen, ob dieses Phänomen von der Ureaseaktivität abhängt, wurden entweder Wildtyp-Zellen (WT) oder Zellen mit Urease-Mangel (ure1∆) in Harnstoffbrühe in einer Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen zusammen mit zellfreiem Medium in den übrigen Zellen gezüchtet 23 Brunnen. Nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C änderten die Medien in der Vertiefung mit WT-Zellen und mehreren umgebenden Vertiefungen ihre Farbe von Gelb nach Rosa, während bei der Platte mit Ure1∆-Zellen keine Farbänderung beobachtet wurde (Abb. 1b, linkes Feld). Die sigmoidale Beziehung zwischen A560 zellfreier Medien und dem Abstand zu Ammoniak produzierenden WT-Zellen (Abb. 1b, rechtes Feld) ähnelte einer pH-Titrationskurve, deren Mittelpunkt der pKa ist. Eine Boltzmann-Kurvenanpassung der Daten ergibt einen Mittelpunktwert von 56 mm und legt nahe, dass der pH-Wert des Mediums in acht Vertiefungen innerhalb dieser Entfernung auf mindestens 7,9 gestiegen ist, dem pKa-Wert von Phenolrot in Harnstoffbrühe. Mit einem tragbaren Ammoniak-Gasdetektor mit einem Bereich von 0–200 ppm war Ammoniak während 30-s-Messungen für Kulturen nachweisbar, die 24 Stunden lang bei 30 °C in Harnstoffbrühe gezüchtet wurden, mit einer minimalen Ausgangszelldichte von 2 × 106 Zellen/ml wenn die Harnstoffkonzentration konstant bei 2 % gehalten wurde (Abb. 1c, linkes Feld) oder mit einer minimalen Harnstoffkonzentration von 0,25 % und einer konstanten Zelldichte von 1 × 108 Zellen/ml (Abb. 1c, rechtes Feld). In beiden Fällen war die kumulative Menge an Ammoniak, die innerhalb von 24 Stunden produziert wurde, erheblich höher, was durch den erhöhten pH-Wert des Kulturmediums bei noch geringeren Zelldichten und Harnstoffkonzentrationen belegt wurde (Abb. 1c).

a Farbfotos (linkes Feld) von Vertiefungen mit Harnstoffbrühe mit der angegebenen Anzahl an C. neoformans-Zellen oder ohne Zellen nach Inkubation bei 30 °C für 2 oder 6 Stunden. Die Absorption zellfreier Medien bei 560 nm (A560) nach 6 Stunden zeigt einen linearen Anstieg mit zunehmender Zellzahl in benachbarten Vertiefungen (rechtes Feld). b Platten mit Harnstoffbrühe in allen Vertiefungen und 1 × 108 Wildtyp- (WT) oder Ure1∆-Zellen in der oberen linken Vertiefung (A1), fotografiert nach 24 Stunden bei 30 °C (linkes Feld). Eine sigmoidale Beziehung zwischen A560 und der Nähe zu Well A1 (rechtes Feld) wird für WT-Zellen, aber nicht für Zellen mit Urease-Mangel beobachtet. c Prozentualer maximaler A560-Wert des Kulturüberstands (rosa) und des Ammoniakgases (NH3, schwarz), gemessen für WT-Kulturen, die 24 Stunden lang bei 30 °C in Harnstoffbrühe gezüchtet wurden, mit zunehmender Ausgangszelldichte (linkes Feld) oder zunehmender Harnstoffkonzentration (rechtes Feld) . Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir, wie sich aus C. neoformans-Zellen freigesetztes Ammoniak auf benachbarte Zellen auswirken würde. Da die chemische Oxidation von Dopamin bei einem alkalischen pH-Wert von 10 leichter erfolgt, gingen wir davon aus, dass ein erhöhter pH-Wert aufgrund der Ammoniakproduktion die Melaninbildung fördern könnte. Tatsächlich zeigten Zellen, die auf Dopamin-supplementiertem Agar in der Nähe von WT wuchsen, im Vergleich zu ure1∆-Zellen in Harnstoffbrühe eine stärkere Melaninpigmentproduktion, die linear mit der Nähe zur Ammoniakquelle zunahm (Abb. 2a). Da C. neoformans am besten bei einem sauren pH-Wert von 11 wächst, wird die Melanisierung routinemäßig in Minimalmedien mit einem pH-Wert von 5,5 getestet. Als der pH-Wert von Dopamin-supplementiertem Agar von pH 5,5 auf 7 titriert wurde, stieg die Pigmentproduktion deutlich von pH 6 auf 6,5 und von pH 6,5 auf 7 (Abb. 2b). Dies legt nahe, dass die erhöhte Melanisierung, die bei Zellen beobachtet wurde, die in der Nähe von Ammoniak produzierenden Zellen wachsen, das Ergebnis eines erhöhten pH-Werts des Dopamin-Agars war. Während die Ammoniakproduktion durch in Harnstoffbrühe wachsende WT-Zellen die Melanisierung benachbarter Zellen stimulierte, die auf Dopamin-Agar mit einem pH-Wert von 5,5 wuchsen, führte die Voreinstellung des Mediums auf einen pH-Wert von 7 zu vergleichbaren Pigmentierungsniveaus für WT-, Ure1∆- und zellfreie Kontrollplatten (Abb . 2c, linkes Feld). Nach 48 Stunden bei 30 °C stieg der pH-Wert des Dopamin-Agars nur bei der Platte mit WT-Zellen in Harnstoffbrühe signifikant an, nicht jedoch bei Platten mit Ure1∆ oder zellfreien Kontrollen (Abb. 2c, rechtes Feld). Wir untersuchten auch die Auswirkung der Ammoniakfreisetzung auf das Wachstum von C. neoformans in nahegelegenen Bohrlöchern und stellten fest, dass der pH-Wert des Mediums mit zunehmender Nähe zur Ammoniakquelle proportional anstieg und dass das Wachstum beeinträchtigt wurde, wenn der pH-Wert auf 8,5 oder höher stieg (Abb. 2d).

a WT C. neoformans-Zellen melanisierten 24 Stunden lang bei 30 °C auf Agar, ergänzt mit 0,1 (grün) oder 1 mM (orange) Dopamin (DA), in Gegenwart von WT- oder ure1∆-Zellen in Harnstoffbrühe (linke Felder). Die quantifizierte Pigmentierung für drei biologische Replikate zeigt einen linearen Nettoanstieg der Melanisierung mit zunehmender Nähe zu Ammoniak produzierenden WT-Zellen im Vergleich zur Mutante mit Urease-Mangel (rechtes Feld). b WT-Zellen, die 48 Stunden lang bei 30 °C auf 1 mM DA-supplementiertem Agar melanisiert wurden, zeigen eine deutlich erhöhte Pigmentierung bei pH 6,5 und 7,0. n = 4, NS nicht signifikant, ****p < 0,0001; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. c Quantifizierte Pigmentierung (linkes Feld) und pH-Wert von Agar (rechtes Feld) nach 48-stündigem Wachstum von WT C. neoformans bei 30 °C auf Agar mit pH 5,5 oder 7,0, ergänzt mit 1 mM DA, neben einer Vertiefung mit WT oder ure1∆ ( mut) Zellen in Harnstoffbrühe oder zellfreiem Medium (neg). n = 4, NS nicht signifikant, ****p < 0,0001; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. d Wachstumskurven von Zellen, die im angegebenen Abstand von Zellen in Harnstoffbrühe wachsen. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. Der am Ende des Experiments gemessene pH-Wert der Kulturüberstände ist angegeben. e Repräsentative Bilder (obere Felder) von WT-, lac1∆- oder lac2∆-Zellen, die auf 1 mM DA-supplementiertem Agar in der Nähe von WT- oder ure1∆-Zellen in Harnstoffbrühe gewachsen sind. Dargestellt ist der Nettoanstieg der Pigmentierung, der durch Subtrahieren der Messungen für jede Vertiefung in einer ure1∆-Platte von denen der entsprechenden Vertiefung in einer WT-Platte (unteres Feld) berechnet wird. n = 4, NS nicht signifikant, ****p < 0,0001; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. f Fluoreszenz- (GFP) und Hellfeld- (BF) Bilder (obere Felder) von Zellen, die GFP-Laccase 1 nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C in den Spalten 2 bis 6 einer 24-Well-Platte mit WT-Zellen in Harnstoffbrühe exprimieren Spalte 1 (Maßstabsbalken = 5 µm). Der pH-Wert der Kulturüberstände stieg mit zunehmender Nähe zu Ammoniak produzierenden Zellen (unteres linkes Feld, dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten) und die GFP-Fluoreszenzniveaus waren in den beiden Spalten, die der Ammoniakquelle am nächsten waren, deutlich höher (unteres rechtes Feld). n = 3, NS nicht signifikant, *p = 0,0154, **p = 0,0046; einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um festzustellen, ob die erhöhte Pigmentierung als Reaktion auf Ammoniak tatsächlich auf die Melaninproduktion von C. neoformans zurückzuführen ist oder lediglich auf eine erhöhte Autopolymerisation von Dopamin, die auch durch einen alkalischen pH-Wert von 10 beschleunigt wird, haben wir unsere Analyse auf Mutantenstämme erweitert, denen die Melaninproduktion fehlt. Als Reaktion auf Glukosemangel exprimiert C. neoformans zwei Laccase-Gene: LAC1, das primäre Laccase-Gen, dessen Deletion zu einem Albino-Phänotyp führt12, und das zu 75 % identische Homolog LAC2, das auf einem niedrigeren Niveau exprimiert wird und nur ein geringfügiger Melanisierungsfehler beim Löschen13. Wir untersuchten WT-, lac1∆- und lac2∆-Zellen auf Melanisierung auf DA-supplementiertem Agar in Gegenwart von WT- oder ure1∆-Zellen in Harnstoffbrühe und stellten fest, dass die Ammoniak-vermittelte Stimulation der Pigmentproduktion für lac1∆, jedoch nicht für lac2∆ aufgehoben wurde ( Abb. 2e). Somit ist Laccase 1, die primäre Laccase, die für die Melanisierung in C. neoformans verantwortlich ist, auch für die Melanisierungseffekte im Zusammenhang mit diffundierbarem Ammoniak verantwortlich.

Da die durch Laccase 1 katalysierte Melanisierung spezifisch durch Urease-produziertes Ammoniak stimuliert wurde, untersuchten wir den Einfluss von Ammoniakgas auf die Expression von Laccase 1 und die zelluläre Lokalisierung. Die Expression eines Amino-terminalen GFP-Laccase-1-Fusionsproteins ergab, dass das Enzym bei saurem pH-Wert in zytoplasmatischen Vesikeln falsch lokalisiert ist und bei physiologischem pH-Wert von 14 zur Zellwand transportiert wird. Wir haben den GFP-Laccase-1-Expressionsstamm in allen Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet, mit Ausnahme der ersten vertikalen Vertiefungsspalte, zu der WT-Zellen in Harnstoffbrühe hinzugefügt wurden. Nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C wurde die zelluläre Lokalisierung von GFP-Laccase 1 durch Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen sichtbar gemacht. Mit zunehmender Nähe zur Quelle des diffundierbaren Ammoniaks richtete sich GFP-Laccase 1 zunehmend auf die Zellwand (Abb. 2f, obere Tafel), und dies korrelierte mit einem steigenden pH-Wert des Kulturmediums (Abb. 2f, linkes unteres Tafel). Die spektrophotometrische Messung der GFP-Fluoreszenz ergab, dass Zellen in den Vertiefungen, die der Ammoniakquelle am nächsten liegen, deutlich mehr Fluoreszenz aufwiesen als weiter entfernte Zellen (Abb. 2f, unteres rechtes Feld), was mit einer stärkeren GFP-Laccase-1-Expression als Reaktion auf eine erhöhte Alkalität von übereinstimmt die Kulturmedien.

Während durch die Ureaseaktivität erzeugtes Ammoniak die Melanisierung förderte, verringerte die Melanisierung wiederum die Ureaseaktivität dramatisch (Abb. 3a). Melanisierung behindert die Aufnahme von Liposomen in Zellen15 und wir fanden heraus, dass die melanisierte Zellwand in ähnlicher Weise eine Barriere für die Freisetzung extrazellulärer Vesikel darstellt, wie aus der geringeren Fluoreszenz einer lipophilen Sonde in Kulturüberständen melanisierter Zellen im Vergleich zu nicht melanisierten Zellen hervorgeht (Abb. 3b). Um den Einfluss der Melanisierung auf den Vesikeltransport direkter zu untersuchen, verwendeten wir eine kürzlich optimierte Methode zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus auf festen Medien gezüchteten Zellen16, um die Ausbeuten von nicht melanisierten und melanisierten Zellen zu vergleichen. Sowohl der Lipidgehalt als auch die Ureaseaktivität waren bei Vesikelpräparaten aus einer vergleichbaren Anzahl von WT-Zellen, die auf mit 1 mM Dopamin ergänztem Agar gezüchtet wurden, im Vergleich zu Minimalmedien allein signifikant niedriger (Abb. 3c). Für den lac1∆-Stamm, der kein Melaninpigment produziert, waren die extrazelluläre Vesikelausbeute und die Ureaseaktivität für Zellen vergleichbar, die in Abwesenheit oder Anwesenheit von Dopamin gezüchtet wurden (Abb. 3c). Somit behindert Melanin in der Kryptokokken-Zellwand den vesikulären Transport aus den Zellen, was zu einer geringeren Urease-Aktivität führt, da Urease einer der Virulenzfaktoren ist, die in extrazellulären Vesikeln sezerniert werden17. Die verringerte Ureaseaktivität melanisierter Zellen im Vergleich zu nicht melanisierten Zellen äußerte sich auch in einer signifikanten Verringerung der Menge an freigesetztem Ammoniak (Abb. 3d) und der Fähigkeit melanisierter Zellen, die Melanisierung benachbarter Zellen zu stimulieren (Abb. 3e).

a Die Urease-Aktivität, gemessen als A560 der Urease-Brühe-Kulturüberstände im Zeitverlauf, war für nicht melanisierte (NM) im Vergleich zu melanisierten (MEL) Zellen signifikant höher (linkes Feld; n = 3, **p = 0,0045, ****p < 0,0001; Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest) für dreifache Kulturen mit statistisch vergleichbaren Zelldichten (rechtes Feld; n = 3, NS nicht signifikant; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test). b Verminderte Freisetzung extrazellulärer Vesikel aus MEL im Vergleich zu NM-Zellen, gemessen durch Fluoreszenz der lipophilen Sonde 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) in Kulturüberständen. n = 5, ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. c Die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus einer vergleichbaren Anzahl von Zellen (linkes Feld; n = 3, NS nicht signifikant), die auf Minimalmedien (MM) oder mit Dopamin ergänzten (DA) Agarplatten gezüchtet wurden, ergab einen deutlich geringeren Lipidgehalt (mittleres Feld; n = 3). , NS nicht signifikant, ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test) und Ureaseaktivität (rechtes Feld; n = 3, NS nicht signifikant, **p = 0,0074; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test). t-Test) für WT, aber nicht für lac1∆-Zellen, die in Gegenwart von DA gezüchtet wurden. d 24-Well-Platten (links) mit NM- oder MEL-Zellen in Harnstoffbrühe in Well A1 (oben links) und pH-empfindlichem Medium in den verbleibenden Wells, fotografiert nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C. Das Streudiagramm (rechts) von A560 für Vertiefungen innerhalb von 50 mm (umrandet mit Kreisen) von Vertiefung A1 weist auf eine deutlich verringerte Ammoniakproduktion für melanisierte Zellen hin. n = 7, ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. e-WT-Zellen, die 18 Stunden lang bei 30 °C auf 1 mM DA-supplementiertem Agar in Vertiefungen neben NM- oder MEL-WT- oder ure1∆-Zellen in Harnstoffbrühe gezüchtet wurden (linke Felder). Die Grafik (rechts) des quantifizierten Nettoanstiegs der Pigmentierung zeigt eine deutlich stärkere Stimulation der Melanisierung durch NM im Vergleich zu MEL-WT-Zellen. n = 4, ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Einfluss von Urease-produziertem Ammoniak während der Infektion zu untersuchen, wurden Mäuse durch intranasale Inhalation mit etwa 5 × 105 WT- oder Ure1∆-Zellen geimpft und die Infektion konnte 3 Wochen lang fortschreiten. Zu diesem Zeitpunkt waren die mit WT infizierten Tiere im Vergleich zu ure1∆-infizierten Mäusen, die gesund wirkten, deutlich sterbend. Der Vergleich der Pilzbelastung in der Lunge ergab einen Durchschnitt von 6,1 × 108 koloniebildenden Einheiten (KBE) für WT, was mehr als eine Größenordnung über dem Durchschnitt von 3,1 × 107 lag, der für ure1∆ gemessen wurde (Abb. 4a). Bei zwei der zehn mit Ure1∆-Zellen infizierten Mäuse entwickelte sich keine produktive Lungeninfektion, sodass diese Tiere von der weiteren Analyse ausgeschlossen wurden. Die von WT-infizierten Mäusen präparierten Lungen waren im Vergleich zu den von ure1∆-infizierten Mäusen gewonnenen Lungen deutlich massiver (Abb. 4b). In Übereinstimmung mit der Rolle der Urease-Aktivität bei der Verbreitung im Gehirn6,7 war die Pilzbelastung des Gehirns bei intranasal mit Ure1∆ infizierten Mäusen etwa vier Logarithmen niedriger als in der Lunge, wohingegen die CFU bei WT-infizierten Mäusen im Durchschnitt nur etwa 100-fach niedriger waren im Gehirn im Vergleich zur Lunge (Abb. 4a).

Eine intranasale Infektion führte zu einer signifikant höheren Pilzbelastung sowohl in der Lunge als auch im Gehirn von Mäusen, die mit WT (n = 10) infiziert waren, im Vergleich zu ure1∆ (n = 8, Lunge; n = 6, Gehirn). ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. b Die Lungenmasse war bei intranasal mit WT infizierten Mäusen im Vergleich zu ure1∆ ebenfalls signifikant höher. n = 10, WT; n = 8, ure1∆, ****p < 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. c Ammoniakspiegel gemessen im Ausatmen von WT- oder Ure1∆-infizierten Mäusen, die 2 Minuten lang in einem 55-cm3-Gehäuse eingeschlossen waren. n = 7, ***p = 0,0001; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test. d Der pH-Wert des Lungengewebes, der mit einer MI-407-Nadelelektrode unmittelbar nach der Dissektion und nach der Homogenisierung und Zentrifugation des Gewebes gemessen wurde, war bei Mäusen, die mit WT infiziert waren, im Vergleich zu ure1∆ (n = 10, WT; n = 8, ure1∆, **) signifikant höher. p = 0,0036 bzw. *p = 0,0358). e Repräsentative Bilder (obere Felder) von H & E-gefärbten Lungengewebeschnitten von drei Mäusen, die entweder mit WT oder ure1∆ infiziert waren (blaue Pfeile; Maßstabsbalken = 10 µm). Quantifizierung der Gesamtzahl (unteres linkes Feld; n = 3, *p = 0,0316; ungepaart, zweiseitiger parametrischer t-Test) und des Prozentsatzes (unteres rechtes Feld; n = 3, *p = 0,0274; ungepaart, zweiseitig). parametrischer t-Test) stark melanisierter Kryptokokkenzellen (rote Pfeile), die in Gewebeschnitten von drei infizierten Tieren nachgewiesen wurden. f Repräsentative Hellfeldbilder von drei unabhängigen Präparaten melaninreicher Partikel, die aus der Lunge von Mäusen isoliert wurden, die entweder mit WT- oder Ure1∆-Zellen infiziert waren, nachdem homogenisiertes Gewebe in konzentrierter Salzsäure gekocht wurde. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir gingen davon aus, dass Urease-positiver C. neoformans während einer akuten Lungeninfektion nachweisbare Mengen Ammoniak produzieren würde. Durch das Einschließen infizierter Tiere in einem kleinen luftdichten Behälter für 2 Minuten wurde ein durchschnittlicher Wert von 1,1 ± 0,5 ppm Ammoniakgas im Atem von WT-infizierten Tieren gemessen, verglichen mit ure1∆-infizierten Mäusen, bei denen Ammoniakgas nicht nachweisbar war (Abb. 4c). Zum Vergleich wurde ein vergleichbarer Ammoniakwert von ~1,5 ppm für 2 × 106 C. neoformans-Zellen gemessen, die in Gegenwart von 2 % Harnstoff wuchsen (Abb. 1c). Wir haben unsere Untersuchung erweitert, indem wir den pH-Wert infizierter Lungen nach der Dissektion gemessen haben, indem wir das Gewebe mit einer Nadel-pH-Elektrode untersucht haben. Diese Messungen ergaben einen signifikant höheren pH-Wert in der Lunge von WT im Vergleich zu ure1∆-Mäusen (Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass Urease-positive Tiere ausreichend Ammoniak produzieren, um den pH-Wert des infizierten Gewebes zu erhöhen. Um mögliche regionale Schwankungen des pH-Werts im gesamten Organ zu kontrollieren, wurde präpariertes Lungengewebe in steriler Kochsalzlösung homogenisiert und der pH-Wert des resultierenden zellfreien Überstands mit einer Standard-pH-Elektrode gemessen. In Übereinstimmung mit den In-situ-Messungen war der pH-Wert von Lungengewebehomogenaten bei aus WT stammenden Tieren signifikant höher als bei mit Ure1∆ infizierten Tieren (Abb. 4d). Unsere Ergebnisse offenbaren eine zuvor unerwartete Folge einer Infektion mit C. neoformans, nämlich dass durch die Ureaseaktivität gasförmiges Ammoniak freigesetzt wird, das die Zellumgebung des infizierten Gewebes durch Erhöhung des pH-Werts verändert.

Da die Melanisierung bei höheren pH-Werten in vitro zunahm (Abb. 2), stellten wir die Hypothese auf, dass ein ureaseabhängiger Anstieg des Lungen-pH-Werts die Melanisierung in vivo ebenfalls fördern würde. Leider unterscheiden silberbasierte Färbemittel melanisierte von nicht melanisierten C. neoformans-Zellen nicht zuverlässig, da die Färbemittel auch mit Polysacchariden in der Zellwand reagieren18,19. Trotz dieser Einschränkung war es möglich, tief pigmentierte C. neoformans-Zellen vom umgebenden Gewebe in mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Schnitten infizierter Galleria mellonella20 zu unterscheiden. In ähnlicher Weise konnten wir eine kleine Anzahl stark melanisierter Zellen in H & E-gefärbten Abschnitten des Lungengewebes von Mäusen nachweisen, die mit WT oder ure1∆ infiziert waren (Abb. 4e, oberes Feld). Da sich im Laufe der Zeit zunehmend Melaninschichten in der Zellwand ablagern21, ist die Anzahl der nachgewiesenen stark pigmentierten Zellen wahrscheinlich eine repräsentative Unterschätzung der Gesamtzahl der melanisierten Zellen. In gefärbten Abschnitten von Lungengewebe, die mit WT infiziert worden waren, wurde im Vergleich zu ure1∆-Zellen eine signifikant größere Anzahl melanisierter Zellen identifiziert (Abb. 4e, unteres linkes Feld). Um den 10-fachen Unterschied in der Lungen-KBE für WT- und Ure1∆-infizierte Tiere zu berücksichtigen, wurden gleich große Bereiche um jede melanisierte Zelle herum für die Gesamtzahl der Kryptokokkenzellen quantifiziert. Diese Analyse ergab einen signifikant höheren Prozentsatz melanisierter Zellen für WT im Vergleich zu ure1∆ (Abb. 4e, unteres rechtes Feld). Kryptokokken-Melanin ist säurestabil22 und wir entdeckten charakteristische säurebeständige Melanin-„Geister“-Partikel nach einstündigem Kochen von Lungengewebeproben in konzentrierter Salzsäure (Abb. 4f), die bei WT etwa dreimal häufiger vorkamen als bei Ure1∆. Die erhöhte Anzahl melanisierter WT im Vergleich zu Ure1∆-Zellen in infiziertem Lungengewebe steht im Einklang mit unseren In-vitro-Beobachtungen, dass die Melanisierung durch die Urease-abhängige Ammoniakproduktion gefördert wurde.

Da die Melanisierung das Überleben von C. neoformans während der Koinkubation mit Makrophagen erhöht4, versuchten wir, diese Analyse zu erweitern, indem wir Mäuse intravenös mit Makrophagen infizierten, die entweder nicht melanisierte oder melanisierte C. neoformans-Zellen enthielten. Wir haben 24 Stunden nach der Infektion mit melanisierten Zellen eine signifikant höhere Pilzbelastung in Lunge und Gehirn von Tieren gemessen als mit nicht melanisierten Zellen (Abb. 5a). Diese Beobachtung stützt ein Modell, wonach melanisierte Zellen länger in Phagolysosomen verbleiben können als nicht melanisierte Zellen. Wir verglichen auch Infektionen mit Makrophagen, die nicht melanisierte und melanisierte Ure1∆-Zellen trugen, und obwohl die CFU im Lungengewebe vergleichbar waren, gab es im Gehirn eine deutlich größere Anzahl melanisierter Zellen im Vergleich zu nicht melanisierten Zellen (Abb. 5b).

Quantifizierte Pilzbelastung in Lunge und Gehirn von Mäusen 24 Stunden nach intravenöser Infektion mit 2 × 105 Makrophagen, die NM- oder MEL-WT tragen ((a) n = 4, *p = 0,0167 bzw. 0,0300 für Lunge und Gehirn; ungepaart, zwei- zweiseitiger parametrischer t-Test) oder ure1∆ ((b) n = 5, NS nicht signifikant, *p = 0,0414 für Gehirn; ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Test). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

C. neoformans hat zahlreiche Schutzeigenschaften entwickelt, die das Überleben in Lebensräumen wie Erde und Baumrinde fördern, wo diese vor amöboiden Raubtieren schützen23. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen Amöben und Makrophagen in ihrer Interaktion mit diesem Pilz24 wirken viele von ihnen auch als Virulenzfaktoren. Beispielsweise bietet die Polysaccharidkapsel Schutz vor Austrocknung in der Umwelt und ermöglicht es Kryptokokkenzellen, dem Angriff des Immunsystems des Wirts zu entgehen25. Mehrere andere Faktoren werden in extrazellulären Vesikeln, sogenannten „Virulenzbeuteln“17, abgesondert, darunter Urease, die Harnstoff hydrolysiert, um Ammoniak zu produzieren26, und Laccase, die die Oxidation von Phenolvorläufern zu Melanin katalysiert27. Die Bemühungen zur Behandlung oder Vorbeugung von Kryptokokkose konzentrierten sich größtenteils auf die Bekämpfung eines dieser Faktoren, beispielsweise Impfstoffe, die auf den Glucuronoxylomannan (GXM)-Zuckerkomponentenmotiven der Kapsel basieren28 oder Antikörper gegen Melanin29. Trotz konzertierter Bemühungen an diesen Fronten30 wurde noch kein wirksamer Impfstoff entwickelt und die derzeitigen Antimykotika-Therapien bieten keinen vollständigen Schutz31. Angesichts der Vielschichtigkeit der Virulenz von C. neoformans kann die Entwicklung erfolgreicher Krankheitsbehandlungs- oder Präventionsstrategien von einem kombinatorischen Ansatz profitieren, der die mögliche Wechselwirkung zwischen einzelnen Virulenzfaktoren berücksichtigt.

Urease ist ein weit verbreitetes Enzym in Mikroorganismen, das eine ernährungsphysiologische Rolle bei der Gewinnung von Stickstoff aus Harnstoff spielt und gleichzeitig als Virulenzfaktor für viele pathogene Bakterienarten, einschließlich Helicobacter pylori, Proteus mirabilis und Klebsiella pneumoniae32,33,34 sowie Pilze wie z als C. neoformans und Coccidioides posadasii26,35. Die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniak durch diese Mikroben trägt zur Pathogenese bei, indem sie Gewebeschäden hervorruft und Umgebungen mit niedrigem pH-Wert puffert36. H. pylori produziert so viel Ammoniak, dass sein Vorhandensein im menschlichen Atem zur Diagnose einer Infektion herangezogen wird37. Wir entdeckten eine kleine, aber messbare Menge Ammoniakgas in der Ausatmung von Mäusen, die in ihrer Lunge eine schwere Pilzlast aus Urease-positiven C. neoformans-Zellen trugen, was eine Ureaseaktivität während einer Kryptokokkeninfektion belegte. Es wurde festgestellt, dass Ammoniak als Signalmolekül wirkt, das das Wachstum und die Entwicklungsergebnisse mehrerer Pilzarten verändern kann38,39,40. Daher ist es bei der Betrachtung der Auswirkungen von Urease auf die Virulenz wichtig, auch die Auswirkungen ihres Produkts zu berücksichtigen, das durch Gewebe diffundieren und während der Pathogenese aus der Ferne wirken kann. Wir entdeckten eine unerwartete Rolle der Urease, die über ihre Rolle bei der Modulation des pH-Werts in Phagolysosomen hinausgeht5, da ihr flüchtiges Produkt, Ammoniak, den pH-Wert in der Ferne erhöht, um die Melanisierung benachbarter Zellen zu fördern. Der alkalische pH-Wert beeinflusst die Melaninproduktion über einen vielschichtigen Mechanismus, da er die chemischen Reaktionen fördert, die zur Polymerisierung von Melaninvorläufern erforderlich sind10, und außerdem die Expression und Zellwandlokalisierung von Laccase 1, dem Enzym, das die Reaktion katalysiert, erhöht. Als wir das Ergebnis einer murinen Infektion mit Makrophagen verglichen, die melanisierte und nicht melanisierte C. neoformans-Zellen tragen, stellten wir fest, dass die Melanisierung die Hirninvasion steigerte, höchstwahrscheinlich durch die Verlängerung des Überlebens von Kryptokokkenzellen in Makrophagen, um die Transmigration durch einen Trojaner-Mechanismus zu fördern. Unsere Ergebnisse zeigen, wie ein in einer Zelle wirkender Virulenzmechanismus die Virulenz benachbarter Zellen aus der Ferne modulieren kann und so einen neuen Mechanismus für die intrazelluläre Kommunikation mikrobieller Zellen während einer Infektion etabliert.

Während Urease die Melanisierung förderte, zeigten melanisierte Zellen eine verringerte Urease-vermittelte Ammoniakfreisetzung. Das Wachstum von C. neoformans in Gegenwart von Melaninvorläufern hat keinen Einfluss auf die Urease-Expression41, aber die Melaninablagerung auf der Kryptokokken-Zellwand verringert die Zellwandporosität42 und die Permeabilität der Zellen für Liposomen15. Wir fanden heraus, dass die Melanisierung auch die Freisetzung extrazellulärer Vesikel aus dem Zellinneren behindert, und da Urease zu den in Vesikeln transportierten Virulenzfaktoren gehört, verringerte sich dadurch die Ureaseaktivität für melanisierte Zellen. Da das Wachstum von C. neoformans bei niedrigem pH-Wert11 begünstigt und unter alkalischen Bedingungen gehemmt wird (Abb. 2d), verringert die Melanisierung die Freisetzung ureasehaltiger Vesikel und begrenzt dadurch wiederum die Ammoniakproduktion, um den pH-Wert im optimalen Wachstumsbereich zu halten. Wir schlagen ein Modell vor, bei dem die umgekehrte Beziehung zwischen Urease und Melanisierung einen Rückkopplungsmechanismus bereitstellt, der Pilzzellen die Möglichkeit gibt, die Urease-Aktivität als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen schnell anzupassen (Abb. 6).

Die Replikation von C. neoformans wird bei niedrigem pH-Wert bevorzugt, aber mit zunehmender Populationsdichte nimmt auch die Urease-vermittelte Freisetzung von Ammoniakgas zu, was zu einer alkalischeren Umgebung führt. Die Kombination aus verstärkter Melanisierung und langsamerer Replikation bei hohem pH-Wert verlängert die Persistenz von Kryptokokkenzellen in Phagosomen, um die Verbreitung im Gehirn durch einen Trojaner-Mechanismus zu steigern. Die Ablagerung von Melanin in der Zellwand sorgt für einen Rückkopplungsmechanismus, indem sie die Freisetzung von Urease-tragenden extrazellulären Vesikeln verhindert, um den Ammoniakspiegel zu senken und den optimalen pH-Wert für das Wachstum wiederherzustellen. Es wird erwartet, dass schnellere Wachstumsraten die Häufigkeit der lytischen Freisetzung aus Phagozyten erhöhen und so die Durchquerung der Blut-Hirn-Schranke durch freie Hefezellen begünstigen.

Die wechselseitige Abhängigkeit zwischen zwei Virulenzfaktoren, Ureaseaktivität und Melanisierung, stellt eine neue Eigenschaft in der Pathogenese von C. neoformans dar, die dazu dient, das Überleben des Pilzes während der zeitlichen und räumlichen Schwankungen, die im Verlauf der Infektion auftreten, zu maximieren. Nach der Inhalation werden eindringende Kryptokokkenzellen von Lungenmakrophagen verschlungen, und diese Begegnung hat mehrere mögliche Folgen. Die Wirtszelle kann die Hefe abtöten oder die Pilzzellen können in der phagozytischen Wirtszelle überleben und sich vermehren, was schließlich zu einer lytischen oder nicht-lytischen Exozytose führt8. Urease spielt eine zentrale Rolle für das Ergebnis dieser anfänglichen Pathogen-Wirt-Interaktion, da die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniak den phagosomalen pH-Wert erhöht und die intrazellulären Wachstumsraten verringert, um die Persistenz von Kryptokokkenzellen innerhalb der Wirtszelle zu begünstigen5. C. neoformans zeichnet sich unter den pathogenen Pilzen dadurch aus, dass er einen bemerkenswerten Neurotropismus zeigt, so dass sich die meisten Fälle von Kryptokokkose als Meningoenzephalitis manifestieren. Bei einer disseminierten Gehirninfektion müssen Kryptokokkenzellen die Blut-Hirn-Schranke passieren, entweder als freie Hefezellen oder durch einen „Trojanischen Pferd“-Mechanismus in Makrophagen transportiert43. Während Urease auf dem ersten Weg eine entscheidende Rolle spielt6,7, ist sie auf dem zweiten Weg möglicherweise weniger wichtig. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Melanisierung aufgrund der Verlängerung des Überlebens in Phagolysosomen die Häufigkeit erhöhen kann, mit der Zellen in Makrophagen in das Gehirn transportiert werden, um den Verlust an Urease zumindest teilweise auszugleichen.

Zusammenfassend berichten wir, dass zwei wichtige Virulenzfaktoren von C. neoformans sich gegenseitig modulieren, so dass Urease flüchtiges Ammoniak produziert, das durch Wirkung aus der Ferne Auswirkungen auf benachbarte Zellen vermittelt, um den pH-Wert zu erhöhen und dadurch die Melanisierung zu fördern, was wiederum die Ureaseaktivität verringert Hemmung der Sekretion von Vesikeln, die das Enzym tragen. Die gegenseitige Modulation der Melanin- und Ureaseproduktion führt wiederum zu Pilzzellen mit unterschiedlichen Eigenschaften und Widerstandsfähigkeiten, die das Überleben und die Verbreitung in verschiedenen Phasen der Kryptokokkose fördern können. Bei Mikroorganismen, die mehrere Virulenzfaktoren exprimieren, ist es wichtig, diese im Kontext zueinander zu untersuchen, da ihre kombinierten Wirkungen möglicherweise nicht vorhersehbar sind. Tatsächlich erfordert die faszinierende Möglichkeit zusätzlicher Wechselwirkungen zwischen einzelnen Virulenzfaktoren in C. neoformans zukünftige Untersuchungen. Es kann beispielsweise auch erwartet werden, dass Urease das Kapselwachstum beeinflusst, da Zellen größere Kapseln haben, wenn sie bei pH 7 im Vergleich zu pH 544 gezüchtet werden. Die hier beschriebene gegenseitige Abhängigkeit zwischen Urease- und Melaninproduktion während einer Kryptokokkeninfektion zeigt neue Eigenschaften, die nicht vorhersehbar sind. noch auf ihre bekannten Einzelfunktionen reduzierbar. Die Koordination zwischen einzelnen Virulenzfaktoren könnte dazu beitragen, dass Virulenz eine aufkommende Eigenschaft auf der Ebene der Wirt-Mikroben-Interaktionen ist45 und die Anerkennung dieser Komplexität sollte künftige Bemühungen zur Bekämpfung der mikrobiellen Virulenz leiten.

Alle Tierversuche wurden mit vorheriger Genehmigung des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Johns Hopkins University unter der genehmigten Protokollnummer MO21H124 durchgeführt. Der Umgang mit Mäusen und die Euthanasie mit CO2 in einer geeigneten Kammer wurden gemäß den Richtlinien zur Euthanasie der American Veterinary Medical Association durchgeführt. Die Johns Hopkins University ist von AAALAC International akkreditiert, entspricht den Vorschriften des Animal Welfare Act und den Richtlinien des Public Health Service (PHS) und verfügt über eine vom PHS anerkannte Tierschutzversicherung beim NIH Office of Laboratory Animal Welfare.

Der Wildtyp-Stamm KN99α von Cryptococcus neoformans Serotyp A und die Laccase-1-Deletionsmutante lac1∆ wurden aus der gendeletierten Bibliothek des Fungal Genetics Stock Center erhalten46. Die Laccase-2-Deletionsmutante lac2∆ (RPC 26)13 wurde von Joseph Heitman und J. Andrew Alspaugh (Duke University, NC) erhalten. Der Urease-defiziente Mutant ure1∆26 und der GFP-Laccase-1-Stamm14 wurden freundlicherweise von John Perfect (Duke University, NC) bzw. Peter Williamson (NIH, MD) zur Verfügung gestellt.

WT- oder ure1∆-Cryptococcus neoformans-Zellen, die aus gefrorenen 50 % Glycerin-Vorräten durch Wachstum bei 30 °C in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) gewonnen wurden, wurden in Harnstoffbrühe9 mit der in jeder Abbildungslegende angegebenen Zelldichte subkultiviert und in übertragen die angegebene Vertiefung einer 24-Well-Platte. Nach dem Beladen der verbleibenden Vertiefungen mit zellfreier Harnstoffbrühe wurden die Platten mit Parafilm versiegelt und für die angegebene Zeit bei 30 °C inkubiert. Der Farbwechsel des zellfreien Mediums von Gelb nach Rosa war ein Hinweis auf einen erhöhten pH-Wert als Folge von Ammoniak, das aus in Harnstoffbrühe wachsenden Zellen diffundierte. Die Platten wurden mit einer 12-Megapixel-Kamera fotografiert und die Absorption bei 560 nm (A560) wurde für jede zellfreie Vertiefung unter Verwendung der Softmax Pro 7.1-Software mit einem SpectraMax iD5 Multimode-Mikroplattenlesegerät (Molecular Dynamics) gemessen. A560 einer Harnstoffbouillon-Kontrolle wurde von jedem Messwert abgezogen. Eine ähnliche Methode wurde verwendet, um die Ammoniakdiffusion aus nicht melanisierten und melanisierten Zellen zu vergleichen, mit der Ausnahme, dass WT-Zellen 6 Tage lang in einem der beiden Minimalmedien (MM), bestehend aus 29,4 mM K2HPO4, 10 mM MgSO4, 13 mM Glycin, 15 mM, vorgezüchtet wurden D-Glucose und 3 µM Thiamin bei pH 5,5 oder MM, ergänzt mit 1 mM Dopaminhydrochlorid (DA, MilliporeSigma H8502), bevor sie bei einer Dichte von 5 × 107 Zellen/ml in Harnstoffbrühe subkultiviert werden.

WT-Zellen wurden in Harnstoffbrühe bei 30 °C 24 Stunden lang gezüchtet, entweder mit der gleichen Ausgangszelldichte von 1 × 108 Zellen/ml und einem Bereich von Harnstoffkonzentrationen oder mit einer konstanten Harnstoffkonzentration von 2 % und einem Bereich von Ausgangszelldichten . Eine ure1∆-Kontrollkultur wurde mit einer Zelldichte von 1 × 108 Zellen/ml in Harnstoffbrühe mit 2 % Harnstoff inokuliert. Der Sensor eines BT-5800G-Ammoniakgasdetektors mit einem Bereich von 0–200 ppm wurde 30 s lang direkt über ein konisches 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml jeder Kultur gehalten und die Messwerte wurden aufgezeichnet. Die Messungen für jede WT-Kultur wurden durch Subtrahieren der niedrigen Hintergrundmessung der ure1∆-Kontrolle korrigiert und dann als Prozentsatz des Maximums von 200 ppm ausgedrückt. A560 zellfreier Überstände, die durch 5-minütige Zentrifugation bei 2500 g gesammelt wurden, wurden gemessen, von der Hintergrundabsorption der zellfreien Harnstoffbrühe abgezogen und als Prozentsatz des Maximalwerts ausgedrückt.

MM, ergänzt mit 0,1 oder 1 mM DA und 1,5 % Agar, wurde in die angegebenen Vertiefungen einer 48-Well-Platte gegeben und erstarren gelassen. Jede Vertiefung mit DA-supplementiertem Agar wurde mit 5 × 105 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschenen WT-Zellen betupft und dann wurden entweder WT oder ure1∆ in Harnstoffbrühe bei einer Zelldichte von 5 × 107 Zellen/ml in den Vertiefungen A1 kultiviert. A6 derselben Platte, so dass die Melanisierung in einem Abstand von 13, 26, 39, 52, 65, 78 oder 91 mm untersucht wurde. Mit Parafilm umwickelte Platten wurden 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert und dann mit einer 12-Megapixel-Kamera fotografiert. Die Bilder wurden mit Adobe Photoshop in Graustufenbilder umgewandelt und die Intensität der Pigmentierung für jeden Punkt wurde mit der Software Image Studio Lite 5.2 (Li-Cor Biosciences) quantifiziert. Um den Nettoanstieg der Melanisierung durch die Diffusion von Ammoniak abzuleiten, wurden die Pigmentierungsmessungen für jede Vertiefung in einer ure1∆-Platte von denen der entsprechenden Vertiefung in einer WT-Platte abgezogen. Eine Variation dieses Assays wurde verwendet, um die Melanisierung durch WT, lac1∆ und lac2∆ auf 1 mM DA-supplementiertem Agar neben einer Vertiefung zu vergleichen, die WT oder ure1∆ in Harnstoffbrühe enthielt, wie oben beschrieben.

MM ergänzt mit 1 mM DA, 5 mM Ascorbinsäure (um die bei hohem pH-Wert auftretende Selbstpolymerisation von DA zu minimieren) und einem universellen Puffersystem bestehend aus 20 mM Tris-HCl, 20 mM Bis-Tris und 20 mM Natriumacetat. wurde auf den gewünschten pH-Wert eingestellt und dann mit 1,5 % Agar gemischt und in die Vertiefungen einer Platte mit 4 Vertiefungen verteilt. Verfestigter Agar wurde mit 5 × 105 PBS-gewaschenen WT-Zellen betupft und nach 48-stündiger Inkubation bei 30 °C wurden die Platten fotografiert und die Pigmentierung wie zuvor beschrieben quantifiziert. Eine Variation dieses Tests wurde verwendet, um die Melanisierung auf DA-Agar bei pH 5,5 und 7,0 zu vergleichen, wenn eine Vertiefung Harnstoffbrühe enthielt, ergänzt mit WT- oder Ure1∆-Zellen oder zellfreiem Medium. Der pH-Wert des Agars in jeder Vertiefung am Ende des Experiments wurde mit ColorpHast-pH-Indikatorstreifen gemessen.

WT C. neoformans-Zellen wurden dreifach mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml in 0,25-facher YPD-Brühe in Vertiefungen einer Platte mit 48 Vertiefungen subkultiviert, die 13, 26, 39 oder 52 mm von Vertiefungen entfernt waren, die 5 × enthielten 107 Zellen in Harnstoffbrühe. Die mit Parafilm versiegelte Platte wurde bei 30 °C unter kontinuierlichem Orbitalschütteln in einem Spectromax iD5-Plattenlesegerät inkubiert und die Absorption bei 600 nm wurde in 15-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 36 Stunden abgelesen.

Ein C. neoformans-Stamm, der GFP-markierte Laccase 114 exprimiert, wurde aus einer gefrorenen 50 % Glycerin-Stammlösung durch Wachstum bei 30 °C in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) gewonnen und dann in MM, ergänzt mit 10 µM CuSO4, subkultiviert 3 Tage bei 30 °C. Die Zellen wurden in frisches Medium gewaschen und dann in die Vertiefungen der Spalten 2 bis 6 von drei Platten mit 24 Vertiefungen verteilt, wobei in jede Vertiefung von Spalte 1 8 × 107 WT-Zellen in Harnstoffbrühe gegeben wurden, und dann wurden die Platten mit Parafilm versiegelt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C werden Hellfeld- und GFP-Fluoreszenzbilder (Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 bzw. 520 nm) von lebenden Zellen aus den Spalten 2 bis 6 (Abstand 19,3, 38,6, 57,9, 77,2 oder 96,5 mm) erstellt aus Zellen, die Ammoniak produzieren) wurden mit der Software QCapture-Pro 6.0 mit einer digitalen CCD-Kamera Retiga 1300 (Teledyne Photometrics, Tucson, AZ) auf einem Olympus AX70-Mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) unter Verwendung eines Ölimmersions-100X-Objektivmikroskops erfasst. Die Zellen aus den 4 Vertiefungen in jeder Säule wurden gepoolt und 5 Minuten lang bei 2500 g zentrifugiert und dann wurde der pH-Wert der Kulturüberstände mit einem Accumet AB150 pH-Meter (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) gemessen. Die Zellpellets wurden in 500 µL Medium resuspendiert und die Fluoreszenz wurde unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm quantifiziert.

WT C. neoformans-Zellen, die 4 Tage lang bei 30 °C entweder in MM oder in MM, ergänzt mit 1 mM DA, gezüchtet wurden, wurden mit PBS gewaschen und dann dreifach in Harnstoffbrühe mit einer Dichte von 1 × 108 Zellen/ml in fest verschlossenen Zellen subkultiviert 14-ml-Röhrchen. Nach der Inkubation bei 30 °C für die angegebene Zeit wurden die Kulturproben durch einen Costar Spin-X 0,45 µm Spinfilter durch Zentrifugation bei 10.000 g für 2 Minuten filtriert und A560 der zellfreien Filtrate gemessen. Die anfängliche Zelldichte jeder Kultur wurde bestimmt, indem jeweils eine 10-6-Verdünnung auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SAB) ausplattiert und die koloniebildenden Einheiten (KBE) nach 2-tägiger Inkubation bei 30 °C gezählt wurden.

Extrazelluläre Vesikel im Überstand nicht melanisierter und melanisierter C. neoformans-Kulturen wurden unter Verwendung der fluoreszierenden lipophilen Sonde 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) wie zuvor beschrieben quantifiziert47. Fünf biologische Replikatkulturen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 108 Zellen/ml entweder in MM oder MM, ergänzt mit 1 mM DA, inokuliert und 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, bevor sie in frisches Medium mit 10 µg/ml DPH subkultiviert wurden . Nach weiterer 24-stündiger Inkubation bei 30 °C wurden zellfreie Überstände durch zwei aufeinanderfolgende 5-minütige Zentrifugationen bei 2500 g erhalten. Die Fluoreszenz wurde mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 360 bzw. 430 nm quantifiziert und die Rohmessungen wurden durch Subtraktion der für zellfreie Kontrollmedien gemessenen Hintergrundfluoreszenz korrigiert.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden aus C. neoformans-Zellen isoliert, die auf festen Medien gezüchtet wurden, unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls16 mit den folgenden Modifikationen. WT- oder ∆lac1-Zellen, die aus gefrorenen 50 % Glycerin-Vorräten durch 24-stündiges Wachstum bei 30 °C in YPD-Medium gewonnen wurden, wurden mit PBS gewaschen und dann wurden 1 × 107 Zellen auf Platten mit festem Medium ausgebreitet, die durch 1:1-Dosierung mit 20 ml vorbereitet wurden Mischung aus 3 % Agar und entweder MM, ergänzt mit 10 µM Harnstoff, oder MM, ergänzt mit 10 µM Harnstoff und 1 mM DA. Nach 48-stündiger Inkubation bei 30 °C wurden die Zellen mithilfe einer sterilen Impföse vorsichtig von der Agaroberfläche gewonnen. Die Zellen von 2 Platten wurden in einem Gesamtvolumen von 3 ml sterilem PBS für jedes der 3 Replikate für jede Variable suspendiert. Die Zellzahl wurde durch Zählen der Verdünnungen jeder Probe mit einem Hämozytometer quantifiziert. Nach der Zentrifugation bei 4.000 g für 15 Minuten bei RT wurden die Überstände in neue Röhrchen überführt und bei 14.000 g für 15 Minuten bei RT zentrifugiert. Nach der Passage durch einen 0,8-µm-Filter wurden zellfreie Überstände 1 Stunde lang bei 270.000 g und 10 °C zentrifugiert. Die EV-Pellets wurden in 100 µL 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, resuspendiert.

Die relativen EV-Ausbeuten wurden durch Quantifizierung des Ergosterolgehalts mit einem Amplex RED-Cholesterin-Assay-Kit (Invitrogen, A12216) gemäß dem bereitgestellten Protokoll verglichen. Kurz gesagt ließ man 25 µL jedes EV-Präparats 30 Minuten lang bei 37 °C reagieren und dann wurde die Fluoreszenz mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 550 bzw. 590 nm quantifiziert. Nach der Korrektur der Rohmessungen durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz, die für eine cholesterinfreie Kontrollreaktion gemessen wurde, wurde die Ergosterinkonzentration (µg/ml) aus einer Cholesterin-Standardkurve extrapoliert.

Die Urease-Aktivität wurde für 25 µL jedes EV-Präparats nach der Berthelot-Methode unter Verwendung eines Urease-Aktivitätstestkits (Sigma, MAK120) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Absorption wurde bei 670 nm abgelesen und die Ureaseaktivität (Einheiten/L) wurde durch Extrapolation aus einer Ammoniak-Standardkurve unter Verwendung der Gleichung (A670-Probe – A670-Blindwert) × n / (Steigung × t) berechnet, wobei n der Verdünnungsfaktor ist und t ist die Zeit und blank ist die Nur-Puffer-Assay-Kontrolle.

Tierversuche wurden mit weiblichen C57BL/6 J-Mäusen (Mus musculus) im Alter von 5–7 Wochen (Jackson Laboratories) durchgeführt, die in einer Einrichtung mit einer angestrebten Raumtemperatur von 22 °C und einem akzeptablen Bereich von 19–25 °C gehalten wurden , eine Zielraumfeuchtigkeit von 42 % und einem akzeptablen Bereich von 30–70 % sowie ein 14,5-Stunden-Hell-/9,5-Stunden-Dunkel-Zyklus. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus 50 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin anästhesiert und dann intranasal mit ~ 5 × 105 WT- oder ure1∆-Zellen in einer sterilen 0,9 %igen Kochsalzlösung infiziert. Die KBE für jedes Inokulum, quantifiziert durch Ausplattieren von Reihenverdünnungen auf SAB-Agar, ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S), betrugen 5,8 × 105 bzw. 6,3 × 105 für WT und ure1∆. Das Geschlecht der Modelltiere wurde im Hinblick auf die Übereinstimmung mit etablierten Protokollen für C. neoformans-Infektionen ausgewählt5,26 und es wird nicht davon ausgegangen, dass es das Ergebnis von Experimenten beeinflusst.

Die konische Spitze eines 50-ml-Zentrifugenröhrchens (Fisher Scientific, 06-443-19) wurde entfernt und der Sensor eines BT-5800G-Ammoniakgasdetektors fest in das Röhrchen eingepasst. Während sie unter Ketamin/Xylazin-Anästhesie standen (wie oben beschrieben), wurden Tiere, die 20–22 Tage lang mit WT oder Ure1∆ infiziert waren, mit fest verschlossenem Deckel in das Röhrchen gegeben und die Messwerte auf dem Gaszähler nach 2 Minuten aufgezeichnet.

Mäuse, die 20–22 Tage lang mit WT oder Ure1∆ infiziert waren, wurden durch intraperitoneale Injektion einer tödlichen Dosis Ketamin/Xylazin eingeschläfert (50 mg/kg für WT-infizierte Tiere, die aufgrund einer hohen Pilzbelastung in der Lunge bereits sehr krank waren, oder 150 mg/kg). mg/kg für ure1∆-infizierte Tiere). Infiziertes Lungengewebe wurde durch Präparation freigelegt und mit einer MI-407-Nadel-pH-Elektrode (Microelectrodes Inc., NH) in Kombination mit einem Accumet AB150 pH-Meter und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode untersucht. Die Lungen wurden mit einer DeltaRange-Analysenwaage (Mettler Toledo AT261) gewogen. Lungen- und Gehirngewebe, das in steriler 0,9 %iger Kochsalzlösung durch Durchgang durch ein 100-µm-Zellsieb homogenisiert wurde, wurde seriell verdünnt und auf SAB + P/S-Agar ausplattiert, um die CFU in jedem Organ zu quantifizieren. Proben von homogenisiertem Lungengewebe wurden ebenfalls 5 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und der pH-Wert des resultierenden Überstands wurde mit einem Accumet AB150 pH-Meter gemessen.

Lungengewebeproben von drei Mäusen, die entweder mit WT oder ure1∆ infiziert waren, wurden in neutral gepuffertem 10 % Formalin bei 4 °C fixiert und dann zur histologischen Analyse durch die Johns Hopkins Oncology Tissue Services eingereicht. Aus in Paraffin eingebetteten Proben geschnittene Dünnschnitte (4 µm) wurden auf Superfrost Plus-Objektträger montiert. Nach dem Entparaffinieren und Spülen mit PBS wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und dann gescannt.

Mäuselungengewebe wurde in 3 ml 0,9 %iger Kochsalzlösung homogenisiert, mit einem gleichen Volumen konzentrierter (12 N) Salzsäure gemischt und 1 Stunde lang in einem Wasserbad auf 95 °C erhitzt. Abgekühlte Proben wurden 30 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und säurebeständiges Material wurde in 200 µL PBS resuspendiert. Nasspräparate wurden durch Auftragen von 8 µL-Proben auf Objektträger hergestellt, unter Hellfeldbeleuchtung mit einem Olympus AX70-Mikroskop mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv untersucht und Bilder wurden mit der Software QCapture-Pro 6.0 mit einer digitalen CCD-Kamera Retiga 1300 aufgenommen. Auf jeweils drei Objektträgern betrug die Gesamtzahl der identifizierten Melanin-Geisterpartikel 29 bzw. 8 für Lungengewebe, das von WT- bzw. Ure1∆-infizierten Mäusen stammte.

Aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) wurden aus C57BL/6 J-Mäusen extrahiert und wie zuvor beschrieben differenzieren gelassen5. Den Zellen wurde erlaubt, sich in BMDM-Medium zu differenzieren, das aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Penicillin-Streptomycin, 2 mM GlutaMAX, 1 % HEPES-Puffer, 0,1 % 2-Mercaptoethanol und 20 % L-929-zellkonditionierter Überstand in unbehandelten 100-mm-Kulturschalen (Corning, 430591) für 6–7 Tage bei 37 °C in 9,5 % CO2. Differenzierte Zellen wurden mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen und durch 10-minütige Behandlung mit Cellstripper bei 37 °C aus den Kulturschalen entfernt. Die Zellen wurden in BMDM-Medium gewaschen und mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 °C in 9,5 % CO2 inkubiert. WT- oder ure1∆ C. neoformans-Zellen, die 3 Tage lang bei 30 °C entweder in MM (nicht melanisiert) oder in MM, ergänzt mit 1 mM DA (melanisiert), gezüchtet wurden, wurden in BMDM-Medium mit einer Zelldichte von 5 × 105 Zellen/ml gewaschen und durch Inkubation mit 2 µg/ml 18B7 mAb48 für 30 Minuten bei RT opsonisiert. Das Medium in jeder BMDM-Vertiefung wurde durch Medium mit 1 × 106 C. neoformans-Zellen ersetzt und die Infektion 1 Stunde lang bei 37 °C ablaufen gelassen. Infizierte BMDMs wurden dreimal mit HBSS gewaschen, um freie Hefezellen zu entfernen, und dann in steriler 0,9 % USP-Kochsalzlösung gewaschen. Weibliche C57BL/6 J-Mäuse im Alter von 5–7 Wochen (Jackson Laboratories) wurden durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus 50 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin anästhesiert und durch retroorbitale Injektion mit C. neoformans-beladenen BMDMs infiziert von ~2 × 105 Zellen. Die KBE für jedes Inokulum wurden durch Lyse von BMDMs in sterilem H2O und Ausplattieren von Reihenverdünnungen auf SAB + P/S-Agar quantifiziert. Nach 24 Stunden wurden infizierte Tiere durch CO2-Inhalation eingeschläfert und präparierte Lungen und Gehirne wurden in sterilem PBS durch Passage durch ein 100-µm-Zellsieb homogenisiert. Reihenverdünnungen jedes Gewebehomogenats wurden auf SAB + P/S-Agar ausplattiert und die KBE-Zahlen wurden um geringfügige Unterschiede in den KBE des Inokulums korrigiert.

Die Daten wurden mithilfe der GraphPad Prism 9-Software grafisch dargestellt und auf statistische Signifikanz analysiert. Jeder Datenpunkt in Streudiagrammen bezeichnet ein unabhängiges biologisches Replikat und horizontale Linien bezeichnen den Median. Statistische Analysen wurden unter Verwendung ungepaarter, zweiseitiger parametrischer t-Tests zum Vergleich zweier Datensätze oder einer gewöhnlichen einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest zur Analyse von mehr als zwei Datensätzen durchgeführt (ns = nicht signifikant). , *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Artikel verfügbar sind. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken den Johns Hopkins Oncology Tissue Services für die fachmännische Bereitstellung histologischer Bildgebung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit der Fördernummer R01-HL059842 (AC) unterstützt.

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, 21205, USA

Rosanna P. Baker & Arturo Casadevall

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RPB und AC haben das Projekt konzipiert. RPB entwickelte eine Methodik, erfasste und analysierte Daten und verfasste das Manuskript. AC hat das Manuskript bearbeitet und Fördermittel eingeworben.

Korrespondenz mit Arturo Casadevall.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Agostinho Carvalho und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Baker, RP, Casadevall, A. Die gegenseitige Modulation der Ammoniak- und Melaninproduktion hat Auswirkungen auf die Virulenz von Kryptokokken. Nat Commun 14, 849 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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Eingegangen: 18. August 2022

Angenommen: 07. Februar 2023

Veröffentlicht: 15. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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